抗膽堿酯酶藥對尋常型天皰瘡鼠模型棘層松解的影響

韋高 鄭文軍 周瓊

抗膽堿酯酶藥對尋常型天皰瘡鼠模型棘層松解的影響

韋高 鄭文軍 周瓊

目的通過鼠模型研究抗膽堿酯酶藥對尋常型天皰瘡（PV）棘層松解的影響。方法將55只Balb/c新生鼠分為4組，模型組：15只，將PV患者血清通過皮下注射BALB/c新生鼠建立PV鼠模型；溴吡斯的明組、甲硫酸新斯的明組：各15只，在注射患者血清的同時，分別注射溴吡斯的明及甲硫酸新斯的明；對照組：10只，皮下注射生理氯化鈉溶液。從臨床表現(xiàn)、組織病理和直接免疫熒光三方面評價抗膽堿酯酶藥對PV鼠棘層松解的影響。結(jié)果模型組單獨注射PV患者血清能在BALB/c新生鼠中誘導出PV的改變。模型組棘層松解程度高于溴吡斯的明組（H=21.584，P＜0.001）及甲硫酸新斯的明組（H=20.641，P＜0.001），對照組BALB/c新生鼠未發(fā)生明顯變化。結(jié)論抗膽堿酯酶藥可降低PV鼠模型的棘層松解程度。

天皰瘡；疾病模型，動物；膽堿酯酶抑制劑

天皰瘡是一種自身免疫性大皰性皮膚病，隨著對天皰瘡發(fā)病機制研究的深入，有學者提出“多重打擊學說”［1］，即天皰瘡發(fā)病是由于抗膽堿能受體抗體造成棘層松解，使橋粒芯蛋白等細胞間黏附因子的抗原表位暴露，從而產(chǎn)生相應抗體。同時也有學者報道，85%的天皰瘡患者血清中抗膽堿能受體抗體陽性［2］。基于“多重打擊學說”，擬膽堿能藥物對天皰瘡的非激素治療引起了重視。擬膽堿能藥物分為乙酰膽堿受體激動劑及抗膽堿酯酶藥兩類，其中乙酰膽堿受體激動劑卡巴膽堿對天皰瘡棘層松解的阻斷作用已有動物實驗證實，而抗膽堿酯酶藥是否也存在同樣的效果，僅見個別病例報道［3］，尚缺乏實驗論證。我們擬通過鼠模型探討抗膽堿酯酶藥對尋常型天皰瘡棘層松解的影響。

資料與方法

一、資料

1.天皰瘡患者血清采集及測定：取自1例廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院皮膚科住院患者。病情處于活動期，經(jīng)臨床、常規(guī)病理、直接免疫熒光（DIF）與間接免疫熒光（IIF）檢查確診為尋常型天皰瘡，未經(jīng)糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑治療。采血80 ml后保存于-70℃冰箱。

2.主要試劑：溴吡斯的明干粉（美國Sigma公司），甲硫酸新斯的明注射液（河南潤弘制藥公司），異硫氰酸熒光素（FITC）標記免抗人IgG抗體（北京博奧森公司）。

二、方法

1.實驗動物：BALB/c新生鼠55只，清潔級，出生后3 d，體重1～2 g，廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供（SCXK桂2009-0002）。

2.分組：采用隨機數(shù)字表法將實驗動物分為4組，模型組、溴吡斯的明組及甲硫酸新斯的明組各15只，對照組10只。模型組：于鼠背部皮下注射PV患者血清100 μl/g體重，每天1次，連續(xù)注射2次；溴吡斯的明組：于鼠背部皮下注射PV患者血清（100 μl/g體重）+溴吡斯的明（0.1 μg/g體重），每天 1次，連續(xù)注射2次；甲硫酸新斯的明組：于鼠背部皮下注射PV患者血清（100 μl/g體重）+甲硫酸新斯的明（0.01 μg/g體重），每天 1次，連續(xù)注射 2次；對照組：于鼠背部皮下注射生理氯化鈉溶液（100 μl/g體重），每天1次，連續(xù)注射2次。

3.結(jié)果觀察：第1次注射后24 h及48 h觀察各BALB/c新生鼠皮膚黏膜有無自發(fā)水皰及糜爛面，有無尼氏征出現(xiàn)，48 h后處死。出現(xiàn)尼氏征的BALB/c新生鼠取皮損及其周圍皮膚、未出現(xiàn)尼氏征的取背部皮膚行常規(guī)病理檢查，取腹部皮膚行直接免疫熒光檢查。

4.病理檢查：皮膚標本用4%甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋，切片，常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察并攝片。按文獻[4]方法判定棘刺松解程度。

5.直接免疫熒光檢查：腹部皮膚置于生理氯化鈉溶液，OCT（optimum cutting temperature）組織液包埋，-20℃冰凍切片，切片厚度4 μm，用0.01 mol/L PBS按1∶40稀釋FITC標記的兔抗人IgG抗體，每份標本加入20 μl，置37℃濕盒30 min，PBS沖洗，熒光顯微鏡觀察結(jié)果并攝片。按文獻[5]方法判定免疫熒光強度。

6.統(tǒng)計學分析：用Kruskal-WallisH檢驗比較四組間BALB/c新生鼠棘層松解程度及免疫熒光強度，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、臨床表現(xiàn)

第1次注射后24 h內(nèi)觀察，模型組有3只新生鼠出現(xiàn)自發(fā)性糜爛面、水皰，尼氏征均為陽性；注射后48 h內(nèi)，模型組有5只出現(xiàn)自發(fā)性水皰及糜爛面，15只均出現(xiàn)尼氏征（圖1a）。溴吡斯的明組、甲硫酸新斯的明組及對照組所有BALB/c新生鼠均未出現(xiàn)自發(fā)性糜爛面及水皰；注射后48 h內(nèi)，溴吡斯的明組及甲硫酸新斯的明組各有2只新生鼠出現(xiàn)尼氏征。

二、病理改變

棘層松解程度模型組明顯高于溴吡斯的明組（H=21.584，P＜0.001）及甲硫酸新斯的明組（H =20.641，P＜0.001），差異均有統(tǒng)計學意義，溴吡斯的明組與甲硫酸新斯的明組間差異無統(tǒng)計學意義（H=0.009，P ＞ 0.05）。見表 1、圖 1。

圖1 BALB/c新生鼠第1次注射后48 h組織病理表現(xiàn)（HE×100） 1a：模型組出現(xiàn)典型棘層松解、表皮內(nèi)水皰，部分表皮脫失；1b：溴吡斯的明組表皮結(jié)構(gòu)緊密完整，未見棘層松解或表皮內(nèi)水皰；1c：甲硫酸新斯的明組表現(xiàn)同溴吡斯的明組

圖2 BALB/c新生鼠第1次注射后48 h取材行直接免疫熒光檢查（×100） 2a：模型組熒光較暗，模糊可見IgG抗體在表皮內(nèi)呈網(wǎng)狀沉積；2b：溴吡斯的明組綠色熒光明亮，清晰可見IgG抗體在表皮內(nèi)呈網(wǎng)狀沉積；2c：甲硫酸新斯的明組可見耀眼的亮綠色熒光，清晰可見IgG抗體在表皮內(nèi)呈網(wǎng)狀沉積

表1 BALB/c新生鼠棘層松解程度及免疫熒光強度比較

三、直接免疫熒光檢查結(jié)果

模型組、溴吡斯的明組及甲硫酸新斯的明組間免疫熒光強度差異無統(tǒng)計學意義（H=1.559，P＞0.05），模型組、溴吡斯的明組及甲硫酸新斯的明組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（H=29.619，P＜0.001）。見表 1、圖 2。

討 論

Nguyen等［3］證實，在注射天皰瘡抗體建立天皰瘡鼠模型的同時注射卡巴膽堿能夠阻斷天皰瘡鼠模型棘層松解的產(chǎn)生，從而間接說明膽堿能受體激動劑可能對天皰瘡具有治療作用。Mehta等［6］報道1例PV患者通過吸煙及外用尼古丁貼片獲得顯著治療效果。Nguyen等［3］報道l例難治性鼻部PV患者，通過口服溴吡斯的明片，皮損得到顯著改善，潑尼松量順利減少。一項雙盲研究報道［7］PV患者外用毛果蕓香堿也有確切療效。

在我們的實驗中，注射天皰瘡患者血清建立PV鼠模型的同時，無論是注射溴吡斯的明還是甲硫酸新斯的明，都可以顯著減少天皰瘡鼠模型的棘層松解程度，說明抗膽堿酯酶藥能有效減少天皰瘡棘層松解程度，也進一步證實乙酰膽堿系統(tǒng)在天皰瘡發(fā)病機制中的重要作用。而抗膽堿酯酶藥能否對天皰瘡患者進行有效的治療，還有待進一步臨床實驗論證。

另外，本實驗顯示，在注射天皰瘡患者血清建立天皰瘡鼠模型的同時注射抗膽堿酯酶藥，表皮細胞間免疫熒光強度無明顯變化。這與國外報道的同為擬膽堿能藥物的膽堿能受體激動劑卡巴膽堿能使天皰瘡鼠模型角質(zhì)形成細胞間免疫熒光強度增加這個結(jié)果有所不同［8］。這種差異的原因尚不清楚，可能與藥物本身有關(guān)，也可能與免疫熒光強度測定方法不同有關(guān)。

在我們的實驗中，為提高造模成功率，采用注射方法，將國內(nèi)常用的100 μl血清/只的造模劑量［9］改進為 100 μl血清/g 體重，連續(xù)注射2次。因考慮到BALB/c新生鼠在第1次注射血清后48 h內(nèi)死亡率高，若待PV鼠模型形成后進行藥物注射再觀察，則新生鼠存活時間難以達到，故我們將抗膽堿酯酶藥物與患者血清同時注射，以縮短新生鼠在實驗中所需的存活時間，而由此造成的不足之處在于無法排除二者之間可能存在的相互影響、干擾。在PV鼠模型尚未形成之前即給予抗膽堿酯酶藥物干涉，與PV鼠模型形成之后再給予干涉，實驗結(jié)果是否會存在差別？抗膽堿酯酶藥物與其他天皰瘡治療藥物對PV鼠模型棘層松解程度的影響是否存在差異？這些將是我們在進一步實驗中要探討的問題。

[1]Grando SA.Autoimmunity to keratinocyte acetylcholine receptors in pemphigus[J].Dermatology,2000,201（4）；290-295.

[2]Vu TN,lee TX,Ndoye A,et al.The pathophysiological significance of nondesmoglein targets of pemphigus autoimmunity.Developmentofantibodies againstkeratinocyte cholinergic receptors in patients with pemphigus vulgaris and pemphigus foliaceus[J].Arch Dermatol,1998,134（8）；971-980.

[3]Nguyen VT,Arredondo J,Chernyavsky AI,et al.Pemphigus vulgaris acantholysis ameliorated by cholinergic agonists[J].Arch Dermatol,2004,140（3）；327-334.

[4]王鷹,刁慶春,鐘白玉,等.白介素2、干擾素γ、白介素10對天皰瘡棘層松解影響的研究[J].中華皮膚科雜志,2004,37（7）；425-427.

[5]Schaerer L,Trüeb RM.Direct immunofluorescence of plucked hair in pemphigus[J].Arch Dermatol,2003,139（2）；228-229.

[6]Mehta JN,Martin AG.A case of pemphigus vulgaris improved by cigarette smoking[J].Arch Dermatol,2000,136（1）；15-17.

[7]Iraji F,Yoosefi A.Healing effect of Pilocarpine gel 4%on skin lesions of pemphigus vulgaris[J].Int J Dermatol,2006,45（6）；743-746.

[8]Mahoney MG,Wang Z,Rothenberger K,et al.Explanations for the clinical and microscopic localization of lesions in pemphigus foliaceus and vulgaris[J].J Clin Invest,1999,103（4）；46l-468.

[9]趙肖慶,薛峰,潘萌,等.抗Dsg-3 EC3-4的單鏈抗體片段在尋常型天皰瘡鼠模型中的作用[J].中華皮膚科雜志,2006,39（6）；338-340.

2013-10-28）

（本文編輯：尚淑賢）

Effect of anticholinesterase agents on acantholysis in a mouse model of pemphigus vulgaris

Wei Gao,Zheng Wenjun,Zhou Qiong.Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China

；Zheng Wenjun,Email；591292777@qq.com

ObjectiveTo study the effect of anticholinesterase agents on acantholysis in pemphigus vulgaris（PV） by using a mouse model.MethodsFifty-five neonatal BALB/c mice were divided into four groups；model group injected subcutaneously with the sera of patients with PV （n=15）,pyridostigmine bromide group （n=15）and neostigmine methylsulfate group （n=15）subcutaneously injected with pyridostigmine bromide and neostigmine methylsulfate respectively,in addition to the sera of PV patients,control group subcutaneously injected with sodium chloride physiological solution （n=10）.The effect of anticholinesterase agents on acantholysis in PV was evaluated in terms of clinical presentation,histopathological manifestations and direct immunofluorescence findings.ResultsThe injection of sera from PV patients induced characteristic changes of PV in neonatal BALB/c mice in the model group.The degree of acantholysis in the model group was higher than that in the pyridostigmine bromide group（H=21.584,P＜0.001）and neostigmine methylsulfate group （H=20.641,P＜0.001）.No changes were observed in the control group.ConclusionAnticholinesterase agents can reduce the degree of acantholysis in the mouse model of PV.

Pemphigus；Disease models,animal；Cholinesterase inhibitors

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.011.006

530021南寧，廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院皮膚科

鄭文軍，Email：591292777@qq.com