慢性特發(fā)性蕁麻疹患者相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子FOXP3、RORγt基因的表達(dá)失衡

朱慧蘭 楊婧 李潤祥 梁碧華 梁艷華 畢超

慢性特發(fā)性蕁麻疹患者相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子FOXP3、RORγt基因的表達(dá)失衡

朱慧蘭 楊婧 李潤祥 梁碧華 梁艷華 畢超

目的探討Treg/Th17細(xì)胞在慢性特發(fā)性蕁麻疹發(fā)病機(jī)制中的作用。方法89例CSU患者分為活動期組48例,靜止期組41例,同期我市社區(qū)醫(yī)院健康體檢者48例作為對照組。用熒光定量PCR檢測檢測研究對象外周血單一核細(xì)胞(PBMC)中FOXP3、RORγt mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果活動期組PBMC FOXP3 mRNA表達(dá)水平(0.57±0.19)顯著高于靜止期組(0.11±0.21)和健康對照組(0.13±0.23),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)?；顒悠诮MPBMC RORγt mRNA表達(dá)水平(0.43±0.39)顯著低于健康對照組(0.87±0.43)和靜止期組(0.89±0.40),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論調(diào)控Treg細(xì)胞的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子FOXP3表達(dá)水平升高,調(diào)控Th17細(xì)胞的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子RORγt表達(dá)降低,兩種基因的相互作用導(dǎo)致Treg/Th17細(xì)胞失衡可能是CSU發(fā)生的原因之一。

蕁麻疹;T淋巴細(xì)胞,調(diào)節(jié)性;Th17細(xì)胞;轉(zhuǎn)錄因子

慢性特發(fā)性蕁麻疹(chronic spontaneous urticaria,CSU)是一種多種炎性細(xì)胞參與累及皮膚黏膜的炎癥反應(yīng)過程［1］。目前研究認(rèn)為介導(dǎo)免疫耐受的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的Th17細(xì)胞是兩類不同的T淋巴細(xì)胞,與CSU的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。特異性轉(zhuǎn)錄因子FOXP3調(diào)控Treg細(xì)胞的發(fā)育及相關(guān)細(xì)胞因子的分泌,轉(zhuǎn)錄因子RORγt調(diào)控Th17細(xì)胞的發(fā)育和相關(guān)細(xì)胞因子的分泌。我們通過檢測CSU患者外周血單一核細(xì)胞(PBMC)中FOXP3、RORγt的表達(dá)水平,從Treg/Th17的調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平,探討Th細(xì)胞與CSU發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。

一、對象與方法

1.臨床資料:2012年1-6月,本院納入的89例CSU患者,男42例,女47例,年齡13～58歲,平均32.4歲。根據(jù)CSU患者疾病活動的評估分為靜止期組41例(男20例,女21例)、活動期組48例(男21例,女27例)。入選標(biāo)準(zhǔn):①反復(fù)起風(fēng)團(tuán),單個的皮損持續(xù)時間 ＜24 h,伴或不伴有瘙癢;②每天發(fā)作,病程持續(xù)6周以上;③除外物理性蕁麻疹等有明確誘因的蕁麻疹;④1個月內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素和(或)免疫抑制劑,采血前1周內(nèi)未使用抗組胺藥物;⑤非妊娠或者哺乳的患者,無嚴(yán)重心、肝、腎等主要器官病變及其他系統(tǒng)性疾?。?］。健康對照組48例,男24例,女24例,年齡14～53歲,平均30.0歲,均來自本市社區(qū)醫(yī)院體檢中心健康體檢者,各組性別、年齡之間,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),受試者均簽署知情同意書。

2.癥狀評估:觀察指標(biāo)包括瘙癢程度、皮疹的程度與類型,按0～4級評分。瘙癢程度:0分為無癢感;1分為輕微瘙癢,不煩躁;2分為輕度瘙癢,尚能忍受;3分為中度瘙癢,不影響工作和睡眠;4分為嚴(yán)重瘙癢,影響工作和睡眠。皮疹的程度與類型:0分為無皮疹;1分為全天出現(xiàn)1次;2分為全天出現(xiàn)2次;3分為全天出現(xiàn)3次;4分為全天均有皮疹［3］。

3.標(biāo)本收集:取受試者靜脈血500 μl加入1.5 ml離心管中,密度梯度離心法分離PBMC,PBS洗滌3次,加焦碳酸二乙酯處理水溶解RNA,收集PBMC于1.5 ml微量離心管中至-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.反轉(zhuǎn)錄PCR定量檢測FOXP3、RORγt的表達(dá):參照日本TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑劑盒說明書進(jìn)行,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μl,提取4 μl RNA行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件:37℃15 min,然后85℃5 s。所得cDNA-80℃長期保存。

熒光定量PCR:實驗步驟參照日本TaKaRa公司Premix Ex Taq熒光定量PCR試劑盒說明書,反應(yīng)條件為:93℃5 min,然后93℃30 s,55℃45 s,72℃45 s共40循環(huán),72℃7 min。

5.統(tǒng)計學(xué)分析:用SPSS17.0軟件。定量資料用ANOVA統(tǒng)計方法進(jìn)行比較,數(shù)據(jù)資料以±s表示,相關(guān)性分析采用Spearman法進(jìn)行分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

二、結(jié)果

1.CSU患者FOXP3基因和RORγt基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測結(jié)果,見表1。CSU患者活動期組PBMC FOXP3 mRNA表達(dá)水平顯著高于健康對照組和靜止期組(χ2=18.86,P＜0.05),靜止期組與健康對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。CSU患者活動期組PBMC RORγt mRNA表達(dá)水平顯著低于健康對照組和靜止期組(χ2=18.86,P＜0.05),靜止期組與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.用Spearman法相關(guān)性分析兩種基因表達(dá)水平的關(guān)系,結(jié)果顯示CSU患者FOXP3基因表達(dá)水平與RORγt基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為r=-1,P =0.000。

三、討論

研究發(fā)現(xiàn),CD4+T細(xì)胞除了Th1細(xì)胞,Th2細(xì)胞以外還可分化為Th17和Treg細(xì)胞［4］。Th17細(xì)胞作為一種獨特的CD4T細(xì)胞譜系,介導(dǎo)炎癥反應(yīng),其特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt,調(diào)控Th17細(xì)胞的分化,并且維持分泌功能［5-6］。Treg細(xì)胞在正常機(jī)體維持T淋巴細(xì)胞動態(tài)平衡和免疫耐受的機(jī)制中起著重要作用,其特異性轉(zhuǎn)錄因子FOXP3,對Treg細(xì)胞的作用具有調(diào)節(jié)作用,當(dāng)FOXP3大量減少時,Treg細(xì)胞分化受抑制,數(shù)量減少,甚至可能分化為 Th17細(xì)胞［7］,因此,FOXP3是Treg分化和功能的指標(biāo)。

本文結(jié)果表明,CSU活動期組患者的Th17細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子RORγt表達(dá)水平較健康對照組、靜止期組明顯降低,Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子FOXP3的表達(dá)水平較健康對照組、靜止期組明顯升高。與Chen［8］等研究的PBMC中Treg細(xì)胞含量高于對照組的結(jié)果對應(yīng)。提示CSU患者外周血可能存在Th17/Treg細(xì)胞失衡,且是Treg細(xì)胞高表達(dá),Th17細(xì)胞表達(dá)水平降低,機(jī)體呈免疫抑制狀態(tài)。靜止期患者FOXP3、RORγtmRNA表達(dá)水平與健康對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義,靜止期患者通過抗組胺治療或者生活習(xí)慣的改變,達(dá)到臨床治愈的狀態(tài),可能使CD4T細(xì)胞重新處于被抑制或未被激惹的狀態(tài)。本研究還發(fā)現(xiàn)隨著病情的發(fā)展,FOXP3明顯升高。由于低水平FOXP3促進(jìn)Th17分化,高水平FOXP3的表達(dá)促進(jìn)Treg細(xì)胞增殖。因此作為Treg細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子FOXP3表達(dá)水平升高,導(dǎo)致Treg細(xì)胞增殖,隨著病情的發(fā)展,Th17的分化程度受到更多的限制,并且,FOXP3與RORγt兩基因水平呈顯著負(fù)相關(guān)。RORγt和Foxp3的平衡狀態(tài)決定了細(xì)胞受抗原刺激后向Th17細(xì)胞或向Treg細(xì)胞的分化,兩者的平衡或紊亂決定了機(jī)體的免疫狀態(tài)。

表1 3組FOXP3基因和RORγt基因表達(dá)

［1］Asero R，Riboldi P，Tedeschi A，et al.Chronic urticaria：a disease ata crossroad between autoimmunity and coagulation ［J］.Autoimmun Rev，2007，7(1)：71-76.

［2］Popov TA.Challenges in the management of chronic urticaria［J］.World Allergy Organ J，2011，4(3 Suppl)：S28-S31.

［3］Takahashi H，Ishida-Yamamoto A，Iizuka H.Effects of bepotastine，cetirizine，fexofenadine，and olopatadine on histamine-induced wheal-and flare-response，sedation，and psychomotor performance［J］.Clin Exp Dermatol，2004，29(5)：526-532.

［4］Sun RS，Sui JF，Chen XH，et al.Detection of CD4+CD25+FOXP3+regulatory T cells in peripheral blood of patients with chronic autoimmune urticaria［J］.Australas J Dermatol，2011，52(3)：e15-e18.

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［6］沈斌，冷建杭，王克義，等.慢性特發(fā)性蕁麻疹患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和IL-17水平的研究［J］.中華皮膚科雜志，2010，43(12)：871-872.

［7］Jeron A，Hansen W，Ewert F，et al.ChIP-on-chip analysis identifies IL-22 as direct target gene of ectopically expressed FOXP3 transcription factor in human T cells［J］.BMC Genomics，2012，3：705.

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2013-01-09)

(本文編輯:吳曉初)

Imbalanced expression of transcription factors FOXP3 and RORγt in patients with chronic spontaneous urticaria

Zhu Huilan*，Yang Jing，Li Runxiang，Liang Bihua，Liang Yanhua，Bi Chao.*Guangzhou Institute of Dermatology，Guangzhou 510095，China

Zhu Huilan，Email：zhlhuilan@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the role of regulatory T(Treg)/T helper type 17(Th17)cells in the pathogenesis of chronic spontaneous urticaria(CSU).MethodsEighty-nine patients with CSU were enrolled in this study，including 48 in active stage and 41 in remission stage.Forty-eight health check-up examinees，who were collected from the community hospitals in Guangzhou city，served as the healthy controls.Fluorescence-based realtime quantitative PCR was performed to determine the expression of transcription factors FOXP3 and RORγt in PBMCs from these subjects.ResultsCompared with the patients with CSU in remission stage and healthy controls，the patients in active stage showed a significantly higher level of FOXP3 mRNA(0.57±0.19 vs.0.11±0.21 and 0.13±0.23，bothP＜0.05)，but a significantly lower level of RORγt mRNA(0.43±0.39 vs.0.89±0.40 and 0.87± 0.43，bothP ＜ 0.05).ConclusionsThe expression of Treg cell regulator FOXP3 increases，while the expression of Th17 cell regulator RORγt decreases in patients with CSU，suggesting that the imbalance between Treg and Th17 cells induced by the interaction between FOXP3 and RORγt may be involved in the pathogenesis of CSU.

Urticaria；T-lymphocytes，regulatory；Th17 cells;Transcription factors

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.01.016

廣東省自然科學(xué)基金(S2012020011077)

510095廣州市皮膚病防治所［朱慧蘭、楊婧(廣東醫(yī)學(xué)院在讀研究生)、李潤祥、梁碧華、梁艷華、畢超］

朱慧蘭,Email:zhlhuilan@hotmail.com