PTEN，HIF-1α和VEGF在食管鱗癌組織中的表達(dá)及其意義

竇鵬揮 邢雨彤 周 鋼 朱曉峰 鄒志田 (佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院心胸外科，黑龍江 佳木斯 154002)

食管癌是我國高發(fā)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，因其惡性度高，5年生存率僅20%左右〔1〕。目前因其確切病因及發(fā)病機(jī)制仍不明確，治療方法大都采用手術(shù)結(jié)合大劑量放、化療法，由于反復(fù)多次的放、化療導(dǎo)致患者免疫功能下降，尤其是患者抵抗力降低，容易轉(zhuǎn)移，從而加速了患者死亡;早期發(fā)現(xiàn)和針對其早期浸潤轉(zhuǎn)移入手而進(jìn)行有針對性的治療是該病治療成敗的關(guān)鍵〔2〕。目前公認(rèn)的腫瘤性疾病實質(zhì)上是一種多基因病〔3〕。目前對于PTEN、VEGF與HIF-1α在食管鱗癌中的共同表達(dá)情況及其相關(guān)性研究，在國內(nèi)外尚未見報道。本研究利用RT-PCR、免疫組化技術(shù)研究PTEN、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α及VEGF在食管鱗癌組織中的表達(dá)情況，分析三者與食管鱗癌臨床病理因素的關(guān)系及其相關(guān)性，探討各自功能、相互聯(lián)系及其與食管癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的關(guān)系。

1 實驗方法

1.1 材料 選取我院2010年10月至2013年10月收治的71例食管鱗癌患者組織樣本(所有病例術(shù)前均未經(jīng)過任何放化療及激素治療)，年齡62～84〔平均(72.8±3.1)〕歲;其中16例Tis(原位癌)，24例T1期(只侵及黏膜固有層和下層)，15例T2期(侵及肌層)，9例T3期(侵及食管纖維膜)，7例T4期(侵及鄰近器官區(qū)域)。另收集20例T0期正常組織作為對照，根據(jù)患者病理分期將其隨機(jī)分成四組，四組患者在年齡、性別、病變長度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均不具有顯著性差異(P＞0.05)，具有可比性?？贵w采用兔多克隆VEGF抗體(abcam，美國)，S-P試劑(Maixin，中國)。

1.2 試驗方法

1.2.1 免疫組化(SP法)操作步驟 切片常規(guī)脫蠟至水，并進(jìn)行抗原修復(fù)，緩沖液洗3 min/2次。滴加Ultra V Block，在室溫下孵育5 min以封閉非特異性的背景染色。緩沖液洗5 min/2次。滴加一抗工作液37℃孵育1～2 h。緩沖液洗5 min/2次。滴加 Primary Antibody Enhancer(增強(qiáng)子)，在室溫下孵育20 min。緩沖液洗5 min/2次。滴加 HRP Polymer(酶標(biāo)二抗)，在室溫下孵育30 min。緩沖液洗5 min/2次。滴加DAB Plus Substrate到切片上，孵育3～15 min。自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片，拍照。

1.2.2 RT-PCR操作步驟 采用RT-PCR檢測PTEN、HIF-1α及VEGF基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá):取各例實驗材料一部分，用于提取總RNA。同時針對上述3個基因設(shè)計PCR引物，利用RT-PCR試劑盒檢測個樣本中各個基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS14.0軟件，組間樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗和ANOVA方差分析。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌患者組織內(nèi)PTEN和HIF-1α表達(dá)量特點PTEN mRNA和HIF-1α mRNA表達(dá)水平通過棕色顆粒表達(dá)，多存在于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞和血管細(xì)胞質(zhì)中，測量PTEN、HIF-1α mRNA及VEGF在食管鱗癌患者組織中的表達(dá)量顯示，在不同病理分級患者組織中，各表達(dá)量均具有顯著性差異，PTEN 在 T0、Tis組(0.178 2±0.027 1)及 T1和 T2組(0.168 3±0.039 7)患者中表達(dá)量比 T3和T4組(0.147 0±0.052 4)患者中的表達(dá)顯著增高(P＜0.05)，HIF-1α表達(dá)在T3+T4組中的表達(dá)量(0.233 5±0.074 8)比 Tis(0.102 9±0.045 7)及T1+T2組(0.165 6±0.032 9)患者顯著增高，且均大于T0組患者表達(dá)量。HIF-1α和VEGF的變化趨勢相似。見圖 1，圖 2。

圖1 食管鱗癌及正常組織中PTEN、HIF－1α、VEGF表達(dá)(S-P法，×400)

圖2 食管鱗癌患者組織內(nèi)PTEN、HIF-1α及VEGF表達(dá)量(RT-PCR)

2.2 PTEN，HIF-1α，VEGF與食管鱗癌相關(guān)性研究 PTEN的表達(dá)與 HIF-1α VEGF的表達(dá)均具有顯著相關(guān)性(r=－0.36，－0.68，均 P＜0.05)，而 HIF-1α 的表達(dá)量與 VEGF 表達(dá)量同樣具有顯著相關(guān)性(r=0.72，P＜0.05)。

3 討論

PTEN基因(MMAC1)是具有磷酸酶活性的抑癌基因，可通過抑制腫瘤細(xì)胞浸潤和促進(jìn)細(xì)胞凋亡等多種途徑發(fā)揮抗癌作用，目前研究報道〔4，5〕了一些關(guān)于PTEN蛋白表達(dá)與食管癌關(guān)系的研究，而關(guān)于PTEN基因突變頻率與食管癌的關(guān)系研究較少。HIF-1α是介導(dǎo)細(xì)胞對缺氧微環(huán)境進(jìn)行適應(yīng)性反應(yīng)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，于振濤等〔6〕研究表明HIF-1α不僅促進(jìn)VEGF轉(zhuǎn)錄，也增強(qiáng)VEGF mRNA的穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致增加腫瘤血管生成。Mizokami等〔7〕研究表明，腫瘤抑制基因PTEN即具有抑制HIF-1α表達(dá)和降低HIF-1α穩(wěn)定性的作用，腫瘤細(xì)胞中如果PTEN失活將不能阻斷 HIF-1α的表達(dá)。故文獻(xiàn)〔8〕顯示HIF-1α在肺癌組織中表達(dá)特點是:與病理分期有關(guān)，分期越高表達(dá)越多;與淋巴轉(zhuǎn)移是否轉(zhuǎn)移無相關(guān)性;PTEN蛋白表達(dá)均與HIF-1α蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。這與本文研究結(jié)果相符。VEGF是血小板源性生長因子(PDGF)家族的一個成員，也是迄今所發(fā)現(xiàn)的最重要的促血管生成因子。VEGF基因的表達(dá)受缺氧、多種細(xì)胞因子，類固醇激素，瘤基因，抑瘤基因產(chǎn)物及一些小分子物質(zhì)等因素的調(diào)控。目前關(guān)于VEGF和HIF-1α共同表達(dá)的關(guān)系及相關(guān)性在胃癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等研究〔9，10〕中有相關(guān)報道。

本研究發(fā)現(xiàn)，PTEN、VEGF與HIF-1α基因在所有食管鱗癌患者組織中的表達(dá)量與腫瘤分期具有顯著相關(guān)性，預(yù)示這三種蛋白的表達(dá)可能與食管鱗癌的治療和預(yù)后具有顯著關(guān)系，為開發(fā)新的抗食管癌藥物、尋找新的基因治療靶位提供理論依據(jù)，同時為臨床治療食管癌提供新的思路。

1 Vasudevan KM，Burikhanov R，Goswami A，et al.Suppression of PTEN expression is essential for anti-apoptosis and cellular transformation by oncogenic ras〔J〕.Cancer Res，2007;67(21):10343-50.

2 Gao P，Wange RL，Zhang N，et al.Negative regulation of CXCR4-mediated chemotax is by the lipid phosphatase activity of tumor suppressor PTEN〔J〕.Blood，2005;106(8):2619-26.

3 Huang J，Kontos CD.PTEN modulates vascular endothelial growth factormediated signaling and angiogenic effects〔J〕.J Biol Chem，2002;277(13):10760-6.

4 朱 紅，周龍明.肝癌組織PTEN基因及其相關(guān)因子HIF-1α表達(dá)的研究〔J〕.交通醫(yī)學(xué)，2010;24(4):369-74.

5 戴珍珍，叢玲華.PTEN和HIF-1α蛋白在肺癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性研究〔J〕.全科醫(yī)學(xué)臨床與教育，2011;9(1):8-10.

6 于振濤，趙華鋒，尚曉濱，等.鱗癌中缺氧誘導(dǎo)因子－1α、血管生成因子在食管鱗癌中的表達(dá)及臨床病理意義〔J〕.中華醫(yī)學(xué)雜志，2008;88(35):2465.

7 Mizokami Y，Li J，Zhang X，et al.Hypoxia-inducible factor-1 independent regulation of vascular endothelial growth factor by hypoxia in colon caneer〔J〕.Cancer Res，2004;64(5):1765-72.

8 沈承瀾，沈振斌.血管內(nèi)皮生長因子、缺氧誘導(dǎo)因子-1α在胃癌中的表達(dá)及其對預(yù)后影響的研究〔J〕.中國全科醫(yī)學(xué)，2010;13(8A):2460-6.

9 鄭青平，陳龍華.肝癌組織VEGF、HIF-1α和MMP-2表達(dá)的臨床研究〔J〕.廣西醫(yī)藥，2008;30(3):301-10.

10 孟曉云，陳 躍.Glut1、VEGF、HIF-1α在乳腺癌中的表達(dá)和臨床意義〔J〕.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2008;18(11):1557-64.