基因組重排技術(shù)及其在真菌育種中的應(yīng)用

王麗寧，趙 妍，奚麗萍，陳明杰，*（.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家食用菌工程技術(shù)研究中心，上海20403；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海20306）

基因組重排技術(shù)及其在真菌育種中的應(yīng)用

王麗寧1，2，趙 妍1，*，奚麗萍1，陳明杰1，2，*
（1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家食用菌工程技術(shù)研究中心，上海201403；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306）

基因組重排（genome shuffling）是一種快速提高細(xì)胞表型的新穎的全基因組工程方法，它是基于多親本的原生質(zhì)體遞歸融合，提供了在缺少基因組序列數(shù)據(jù)或網(wǎng)絡(luò)信息情況下的全基因組重組的優(yōu)勢。文中介紹了基因組重排的原理、優(yōu)點(diǎn)及過程，概述了基因組重排在真菌育種中的應(yīng)用，并展望了該技術(shù)的前景。

基因組重排，遞歸原生質(zhì)體融合，真菌育種

育種技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了自然選育、誘變育種、雜交育種、原生質(zhì)體融合育種、基因工程育種等幾個(gè)階段[1-2]，其中自然選育、誘變育種及雜交育種屬于傳統(tǒng)的育種方法。盡管傳統(tǒng)的育種方法曾經(jīng)發(fā)揮著巨大的作用[3-5]，但存在工程量巨大、耗時(shí)長且難于獲取復(fù)雜表型的缺點(diǎn)。自從轉(zhuǎn)基因技術(shù)問世以來，轉(zhuǎn)基因微生物的研究取得了重大的進(jìn)展[6]，但基因工程育種需要對(duì)目的菌株的遺傳背景有較為深刻的了解，這在一定程度上限制了其應(yīng)用。基因組重排（genome shuffling）又稱基因組重組或基因組改組，是一種基于原生質(zhì)體遞歸融合的新型分子育種技術(shù)[7-9]，是分子定向進(jìn)化在全基因組水平上的延伸，它將重組的對(duì)象從單個(gè)基因擴(kuò)展到整個(gè)基因組，從雙親本擴(kuò)展到多親本，從一輪原生質(zhì)體融合擴(kuò)展到多輪原生質(zhì)體融合，因此可以對(duì)菌株的目的性狀進(jìn)行更快以及更大范圍的優(yōu)化組合?；蚪M重排技術(shù)提出后，在細(xì)菌、放線菌以及真菌的育種上都展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢，取得了較好的研究成果。

1 基因組重排的原理及優(yōu)點(diǎn)

1.1 基因組重排的原理

基因組重排是將具有不同表型的菌株進(jìn)行全基因組重組的一種手段，進(jìn)行基因組重排首先需要構(gòu)建一個(gè)含有各種不同正突變的基因組庫（例如通過經(jīng)典的誘變育種得到目的性狀發(fā)生改進(jìn)的不同的正突變菌株就構(gòu)成了所需的基因組庫），隨后將選出的若干個(gè)正向突變株作為出發(fā)菌株，通過原生質(zhì)體融合將這些正突變菌株的基因組進(jìn)行隨機(jī)重組，并篩選目的性狀得到進(jìn)一步改進(jìn)的菌株來進(jìn)行下一輪基因組重排，這樣通過循環(huán)多輪的隨機(jī)重組可以快速、高效地選育出表型得到較大改進(jìn)的新菌種。

1.2 基因組重排的優(yōu)點(diǎn)

與傳統(tǒng)的育種方法相比，基因組重排具有更高的效率。人工選擇育種對(duì)自然條件依賴性強(qiáng)、耗時(shí)長、效率低；誘變育種正向突變率很低，篩選一株優(yōu)良的生產(chǎn)菌株需要大量的時(shí)間和工作量，且連續(xù)的誘變會(huì)使菌株產(chǎn)生“疲勞效應(yīng)”；原生質(zhì)體融合技術(shù)可以扮演類似于有性生殖途徑基因信息交流的作用，但僅限于雙親本之間的重組?；蚪M重排技術(shù)基于多親本之間的遞歸融合，具有更大基因突變來源，遞歸融合還能使正向突變的表型聚集，多輪融合極大地提高了基因交換的概率。Zhang等[7]發(fā)現(xiàn)2輪基因組重排取得的成果相當(dāng)于20年經(jīng)典育種才能完成。綜上所述，擴(kuò)大菌株的基因型和加速菌株進(jìn)化速度是基因組重排技術(shù)最大的優(yōu)勢。此外基因組重排技術(shù)在無需了解微生物代謝途徑、關(guān)鍵酶的表達(dá)基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等背景知識(shí)的前提下，即可應(yīng)用于菌株改良，尤其適合微生物代謝途徑的遺傳改造[10]，并且基因組重排技術(shù)具有操作簡單、易推廣、見效快等特點(diǎn)。

2 基因組重排的過程

簡單來講基因組重排的過程，即從親本庫中選擇性狀優(yōu)良的菌株作為首輪融合的親本進(jìn)行融合，獲得第一代融合株后，從中篩選出目的性狀改進(jìn)的菌株作為第二輪融合的親本，以此類推進(jìn)行多輪融合，主要包含以下操作步驟：

2.1 構(gòu)建親本庫

親本庫即基因組重排中進(jìn)行首輪原生質(zhì)體融合的親本集合體，包含了不同較好的性狀以及多樣性的差異。構(gòu)建親本庫的方式主要有以下幾種。

a.由突變體構(gòu)建：從同一原始菌株出發(fā)，經(jīng)理化誘變獲得不同的正突變體。劉源慧[11]對(duì)米曲霉（Aspergillus oryzae）FS-16分別進(jìn)行紫外誘變和微波誘變，選取4株α-淀粉酶產(chǎn)量提高的突變株與原始菌株FS-16作為親本進(jìn)行重排，得到了α-淀粉酶酶活顯著提高的重組子。

b.由種內(nèi)不同菌株構(gòu)建：同一種內(nèi)的不同菌株，事實(shí)上可以看作是同一種微生物的不同自然突變體，其基因差異、融合頻率以及融合子表型多樣性都要優(yōu)于同一菌株的不同突變體，這對(duì)優(yōu)秀性狀的整合或許更加有效。Gong等[12]從自然界中篩選了5株產(chǎn)乙醇量較高的釀酒酵母（Saccaromyce scerevisiae）來構(gòu)建親本庫，經(jīng)基因組重排后得到的新菌株乙醇產(chǎn)量提高了2倍。

c.由不同種、屬菌株構(gòu)建：來自不同種、屬的菌株，遺傳差異相對(duì)更大，為融合后代提供了更豐富的基因型。Zhao等[13]對(duì)輪枝霉（Diasporangium sp.）與黑曲霉（Aspergillus niger）進(jìn)行基因組重排，獲得了花生四烯酸產(chǎn)量提高的新菌株。

d.由DNA重組技術(shù)構(gòu)建：該方法在細(xì)菌中已有研究報(bào)道，但目前在真菌中應(yīng)用較少。

2.2 融合與融合子的篩選

2.2.1 原生質(zhì)體的制備與融合 原生質(zhì)體的制備是融合的前提，制備原生質(zhì)體主要參考的因素有菌齡、酶的種類、酶的濃度、酶解時(shí)間、溫度、滲透壓穩(wěn)定劑、pH及再生培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)等[14-16]。誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方式有生物病毒法、化學(xué)法及電處理融合法等，其中化學(xué)法和電處理融合法是當(dāng)前最主要的促融方法。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，出現(xiàn)了一些新型的誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法。Gong等[17]用飛秒激光誘導(dǎo)紅發(fā)夫酵母（Phaffia rhodozyma）進(jìn)行細(xì)胞融合，在功率1.38×104W處理0.25s的情況下，酵母融合率達(dá)到了80%。Skelley等[18]運(yùn)用微流體技術(shù)對(duì)細(xì)胞配對(duì)和融合進(jìn)行誘導(dǎo)，能正確配對(duì)和融合的細(xì)胞比例超過了50%，顯著提高了融合效率。

2.2.2 融合子的篩選 從融合后產(chǎn)生的大量重組菌株中篩選出目的菌株關(guān)系到基因組重排的效率，因此篩選方法變得尤為重要。根據(jù)篩選目的不同，篩選方法也多樣。篩選高產(chǎn)物的目的菌株時(shí)，主要依靠產(chǎn)物的物理和化學(xué)性質(zhì)，如在瓊脂培養(yǎng)基上的抑菌圈、透明圈及水解圈等。篩選對(duì)環(huán)境高耐受性的目的菌株時(shí)，則可以利用相應(yīng)的選擇培養(yǎng)基。此外，添加遺傳標(biāo)記也是一種有效的融合菌株篩選方法。翁艷軍[19]選用Met-缺陷型和Arg-缺陷型分別標(biāo)記雙親，在基本培養(yǎng)基上篩選出營養(yǎng)互補(bǔ)的融合子。由于營養(yǎng)缺陷型的獲取較為費(fèi)時(shí)耗力，現(xiàn)在多使用滅活原生質(zhì)體的標(biāo)記方法，即首先采用熱或者紫外線等手段使原生質(zhì)體失活，然后用失活的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，這種標(biāo)記方法又分為單親原生質(zhì)體滅活和雙親原生質(zhì)體滅活。Kang等[20]分別利用紫外線和熱滅活處理的親本進(jìn)行基因組重排研究，最終獲得了表型理想的融合子。由于紫外線滅活損傷的主要是染色體，熱滅活損傷的是細(xì)胞質(zhì)，因此具有不同損傷位點(diǎn)的原生質(zhì)體融合后通過互補(bǔ)作用能夠再生，大大簡化了融合子的篩選工作。近年來隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一些高通量的篩選方法和分析技術(shù)不斷涌現(xiàn)，如液相色譜—質(zhì)譜法、熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)等，這些新技術(shù)顯著提高了目的融合子的篩選效率。

2.2.3 遞歸融合 遞歸融合即從首輪重排的融合子中選出性狀得到改進(jìn)的融合子作為下一輪的親本，將其制成原生質(zhì)體再進(jìn)行融合，重復(fù)以上步驟直至得到理想的融合子。遞歸融合的要義在于進(jìn)行一輪融合后篩選出的融合菌株作為出發(fā)菌株，必須進(jìn)入下一輪融合。

3 基因組重排在真菌育種中的應(yīng)用

基因組重排技術(shù)經(jīng)過十幾年的發(fā)展，在真菌育種上已經(jīng)有了諸多成功的應(yīng)用，尤其在工業(yè)微生物的育種上發(fā)揮了重要的作用，并且體現(xiàn)出越來越顯著的優(yōu)勢。

3.1 利用基因組重排技術(shù)提高真菌對(duì)環(huán)境的耐受性

真菌對(duì)環(huán)境的耐受性主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：對(duì)產(chǎn)物的耐受性、對(duì)基質(zhì)的耐受性、對(duì)副產(chǎn)物的耐受性、對(duì)生長環(huán)境（如溫度、pH及溶劑等）的耐受性?；蚪M重排在改善真菌的耐受性方面比傳統(tǒng)育種方法體現(xiàn)出更多的優(yōu)勢。El-Bondk ly[21]對(duì)海洋真菌曲霉菌（Aspergillus Sp.NRCF5）進(jìn)行2種組合的復(fù)合誘變（亞硝基胍與紫外線、亞硝基胍與溴化乙錠）后，從中選出5株具有最高脫氧葡萄糖（2DG）耐受性的誘變株進(jìn)行了4輪基因組重排，逐步將曲霉菌NRCF5對(duì)2DG的耐受性由0.1%（w/v）提高到1.0%（w/v）。酵母作為一類重要的可利用真菌，研究者們以它為實(shí)驗(yàn)材料，借助基因組重排技術(shù)選育出多個(gè)對(duì)環(huán)境耐受性強(qiáng)的新菌株。Wei等[22]通過4輪基因組重排過程，提高了克魯斯假絲酵母（Candida krusei）對(duì)醋酸的抗性，同時(shí)對(duì)過氧化氫、熱及凍融的抗性都有所增加；Shi等[23]運(yùn)用基因組重排技術(shù)，將工業(yè)酵母菌株SM-3的最高生長溫度提高了20℃，對(duì)乙醇的耐受性提高了15%；Param jit等[24]對(duì)樹干畢赤酵母（Pichia stipitis）進(jìn)行4輪基因組重排后，發(fā)現(xiàn)其對(duì)硬木亞硫酸鹽廢液（HW SSL）的耐受濃度由65%（v/v）提高到了80%（v/v）以上，且重組子能更好地利用木糖和葡萄糖，產(chǎn)生更多的乙醇。這些研究結(jié)果表明，基因組重排是一種快速且有效提高真菌多重抗性的方法。

3.2 利用基因組重排技術(shù)提高真菌產(chǎn)物產(chǎn)量

很多真菌化合物對(duì)人類非常有益，如乙醇、酶、多糖等[25-27]，因此提高真菌代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量可以在一定程度上擴(kuò)大這些物質(zhì)的來源、縮短制造周期、降低生產(chǎn)成本。然而代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的提高依賴于基因水平上多個(gè)位點(diǎn)的協(xié)同變化，運(yùn)用傳統(tǒng)的方法來提高真菌產(chǎn)物產(chǎn)量工作量大且收獲甚微?；蚪M重排基于多親本的基因轉(zhuǎn)移，能夠使目的菌株的優(yōu)良性狀迅速聚集。Zhao等[28]對(duì)樹狀多節(jié)孢（Nodulisporium sylviform）進(jìn)行4輪基因組重排，獲得了3株遺傳性穩(wěn)定的高紫杉醇生產(chǎn)菌株，采用薄層色譜法、高效液相色譜法以及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)紫杉醇進(jìn)行定性和定量分析，發(fā)現(xiàn)重組子F4-26的紫杉醇產(chǎn)量為516.37μg/L，比基因組重排的親本菌株提高了31.52%～44.72%。馮印[29]將出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）CICC 140334經(jīng)誘變后獲得的高產(chǎn)茁霉多糖突變株作為親本進(jìn)行4輪基因組重排，得到多糖產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高了104.43%的重組子。此外研究者們還利用基因組重排技術(shù)，選育出高產(chǎn)纖維素酶[30]、果糖基轉(zhuǎn)移酶[31]、中性蛋白酶[32]以及α-淀粉酶[11，33]的融合菌株，使人們對(duì)真菌的利用率得到顯著提高。

3.3 利用基因組重排技術(shù)提高底物利用率及范圍

在真菌表型工程改造中，真菌對(duì)于底物的高效利用能力也是期望獲得的目的性狀之一，真菌利用底物的能力也可通過基因組重排來提高。Kang等[20]將出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）N3.387進(jìn)行3輪基因組重排后得到菌株F3-2，與野生型菌株相比，新菌株對(duì)原材料的利用率提高了29.0%。Zhao等[13]將輪枝霉（Diasporangium sp.）和黑曲霉（Aspergillus niger）作為首輪基因組重排的親本，經(jīng)過3輪重排后獲得了輪枝霉碳譜擴(kuò)大的菌株，親本菌株只能利用測試8種碳源中的4種，而重排后的新菌株能夠利用全部的8種碳源，這可能是因?yàn)榕c黑曲霉重組后提高了輪枝霉的羧甲基纖維素酶活性，從而擴(kuò)大了利用碳譜的范圍。

3.4 利用基因組重排技術(shù)提高真菌遺傳多樣性

遺傳多樣性對(duì)豐富真菌種質(zhì)資源、促進(jìn)真菌進(jìn)化、提高真菌對(duì)環(huán)境的耐受性等都具有重要意義。董計(jì)巧[34]利用離子束誘變和基因組重排技術(shù)對(duì)斜臥青霉（Penicillium decumbens）JUAIO-1進(jìn)行改造，并采用RAPD技術(shù)對(duì)融合子及其出發(fā)菌株開展了遺傳相似性分析，研究結(jié)果表明融合菌株和出發(fā)菌株既有遺傳相似性，又在基因組水平上發(fā)生了改變。林峻等[35]對(duì)堿性脂肪酶產(chǎn)生菌擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）FS8486菌株和溜曲霉（Aspergillus Tamarii）FS-132進(jìn)行2輪基因組重排，得到的重組子中酶活最高者較出發(fā)菌株FS8486提高了317%，在對(duì)親本及子代菌株進(jìn)行RAPD多態(tài)性分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)基因組重排的兩子代菌株間的遺傳距離（0.6593）要大于兩親本間的（0.544），表明基因組重排確實(shí)能夠有效提高子代菌株的遺傳多樣性。

4 展望

基因組重排依賴于相對(duì)成熟的原生質(zhì)體融合技術(shù)，在傳統(tǒng)育種方法所提供的遺傳多樣性親本的基礎(chǔ)上，通過全基因組水平上的重組使得某一或某些優(yōu)良性狀集聚在后代中，為真菌菌種的性狀改良提供了一個(gè)有利的平臺(tái)。而正突變基因組庫的建立是基因組重排的前提條件，其多樣性以及與育種目標(biāo)的相關(guān)性直接關(guān)系到重排的成功與否，因此在正突變基因組庫的構(gòu)建方面可能需要更多的探索。多親本融合依賴于有效的融合方法以及高效的融合子篩選技術(shù)。相較于傳統(tǒng)的化學(xué)融合與電融合，雖然新興的融合技術(shù)（如激光誘導(dǎo)、微流體技術(shù)等）能夠大幅度提高融合效率，但其使用范圍受到限制，技術(shù)水平也有待進(jìn)一步提高與完善。目前普遍使用的熱滅活與紫外滅活標(biāo)記，雖然可以簡化融合子的篩選，但同樣會(huì)給原生質(zhì)體帶來生理性損傷，影響融合效率，因此融合的標(biāo)記技術(shù)可能需要開展深入研究。與此同時(shí)，目前真菌中高效的融合子篩選方法較少，應(yīng)用水平較低，嚴(yán)重制約了基因組重排的效率，因此高通量的篩選方法是實(shí)現(xiàn)基因組重排的有力保證。

隨著基因組重排技術(shù)的逐步完善以及與其他生物技術(shù)的結(jié)合，使其在真菌菌種改良中的作用越來越重要，目前基因組重排在酵母[12，14，22-24]、青霉[30，34-35]、曲霉[11，31-33，36]等真菌的育種上已體現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢。食用菌是重要的大型真菌，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值與保健功能，既可食用也可藥用[37]，因此食用菌菌種的改良具有重要經(jīng)濟(jì)意義，但目前基因組重排技術(shù)用于食用菌育種中的研究報(bào)道甚少。依據(jù)基因組重排在其他真菌菌種改良中所取得的成就，相信其也能夠在培育豐產(chǎn)、高抗的優(yōu)質(zhì)食用菌菌種方面發(fā)揮獨(dú)特的優(yōu)勢。

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Genome shuffling and its application in fungal-breeding

WANG Li-ning1，2，ZHAO Yan1，*，XILi-ping1，CHEN M ing-jie1，2，*
（1.Institute of Edible Fungi，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding，Key Laboratory of Edible FungiResources and Utilization（South），Ministry of Agriculture of China，National Engineering Research Center of Edible Fungi，Shanghai201403，China；2.College of Food Science&Technology，ShanghaiOcean University，Shanghai201306，China）

The technology of genome shuffling was a novel whole genome engineering app roach for the rapid im p rovement of cellular phenotypes.Based on the recursive p rotop last fusion w ith multi-parental strains，it offers the advantage of recombination throughout the entire genome w ithout the necessity for genome sequence data ornetwork information.This artic le introduced the p rincip le，characteristics and p rocess ofgenome shuffling，summarized its app lication in fungal-b reed ing and p rospec ted the outlook of it.

genome shuffling；recursive p rotop last fusion；fungal-b reed ing

TS201.3

A

1002-0306（2014）18-0362-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.073

2013－12－31 *通訊聯(lián)系人

王麗寧（1990-），女，碩士研究生，研究方向：食藥用菌遺傳育種。

國家食用菌產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系[CARS-24]。