增強UV-B輻射對擬南芥fas1突變體的影響

李婷 韓榕

摘要 隨著臭氧層的變薄和臭氧空洞的出現(xiàn)，到達地球表面的 UV-B 輻射明顯提高，對生物的生長和發(fā)育產(chǎn)生了一定的影響。擬南芥中fas1同源物的敲除也沒有使其出現(xiàn)致死表型， 植物仍然能夠存活， 只是在胚后器官發(fā)生時出現(xiàn)缺陷， 如激活其頂端分生組織處的沉默基因， 導(dǎo)致莖干寬扁， 相應(yīng)的葉序和花序結(jié)構(gòu)紊亂。因此， fas1能夠穩(wěn)定異染色質(zhì)， 使其中的基因保持沉默。以野生型和fas1 突變體擬南芥為材料，對比了不同條件下野生型和 fas1突變體擬南芥的發(fā)芽勢和發(fā)芽率、根長以及根尖分生區(qū)有絲分裂細胞的末期，結(jié)果表明在正常生長條件下WT和 fas1 突變體的發(fā)芽勢和發(fā)芽率、根長以及根尖分生區(qū)細胞在有絲分裂末期的形態(tài)都沒有顯著差異。而在 UV-B 輻射條件下，對比不同組之間的發(fā)芽勢和發(fā)芽率、根長，結(jié)果表明，WT+UV-B 組低于 WT 組，fas1+UV-B 組低于fas1組，fas1+UV-B 組低于 WT+UV-B 組，且差異均達到顯著水平。此外，在UV-B 輻射條件下，觀察到在 fas1+UV-B 組中，有絲分裂也表現(xiàn)出一定的異?，F(xiàn)象。這些結(jié)果表明，fas1基因功能的缺失可能是導(dǎo)致fas1 突變體對 UV-B 脅迫敏感的誘因之一。

關(guān)鍵詞 UV-B;fas1;擬南芥

中圖分類號 Q947.9 文獻標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）17-0001-04

Abstract With the thinning of the ozone layer and the emergence of ozone holes， the UVB radiation reaching the Earths surface is significantly increased， which has a certain impact on the growth and development of organisms. The knockout of the fas1 homolog in Arabidopsis thaliana did not cause a lethal phenotype， and the plant was still alive， only when the postembryonic organ developed defects， such as activation of the silencing gene at its apical meristem， resulting in stem wide and flat， the corresponding leaf order and inflorescence structure were disordered. Therefore， fas1 was able to stabilize heterochromatin and kept the genes in silent. In this paper， the wildtype and fas1 mutants A.thaliana were used as experimental materials to compare the germination potential and germination rate， root length and the terminal phase of mitotic cells in the wildtype and fas1 mutant A.thaliana under different conditions. The results showed that there was no significant difference in germination potential，germination rate， root length and morphology of apical meristem cells at the end of mitosis under normal growth conditions. Under UVB radiation conditions， the germination potential，germination rate and root length between different groups were compared. The results showed that the WT+UVB group was lower than the WT group， the fas1+UVB group was lower than the fas1 group，the fas1+UVB group was lower than the WT+UVB group，the differences reached a significant level. In addition， under UVB radiation conditions， it was observed that mitosis also showed some anomalies in the fas1+UVB group. These results suggested that the loss of fas1 gene function may be one of the incentives for fas1 mutants to be sensitive to UVB stress.

Key words UVB;fas1;Arabidopsis thaliana

太陽光是地球能量的主要來源，而大氣平流層中的臭氧層可以吸收太陽光中的紫外線。20世紀(jì)以來，由于排放到大氣中的氯氟烴以及其他氮化物（如N2O等）增加，引起臭氧層的破壞，已成為人類面臨的重大環(huán)境問題之一。臭氧層變薄及臭氧空洞的出現(xiàn)[1]，導(dǎo)致到達地面的太陽紫外線輻射增強;且平流層中O3每減少1%，到達地面的太陽紫外線輻射增加2%[2]。太陽紫外線（ultraviolet，UV）按波長大小分為3種：UV-A（315～400 nm）、UV-B（280～315 nm）以及UV-C（100～280 nm）。由于臭氧層變薄，因而到達地面的UV-B輻射增強，會危害陸地植物。盡管UV-B是太陽光中最少的成分，其在到達地表的光中占不到0.5%，但它是太陽光光譜中能量最高的，對生物有十分重要的影響[3]。

在植物利用太陽光進行光合作用的同時，它們也經(jīng)受UV-B輻射的增強，這種能量輻射對植物形態(tài)學(xué)建成、生理及物質(zhì)代謝、細胞骨架和細胞周期都有重要影響。增強UV-B輻射后，小麥幼苗葉片和根中微管蛋白含量減少，根尖細胞中微管周期雖然存在，但其結(jié)構(gòu)紊亂，紡錘體微管損傷嚴重影響染色體與紡錘體的結(jié)合，干擾染色體的遷移等;此外，在根尖細胞有絲分裂末期分裂異常，出現(xiàn)多核細胞，這可能與形成細胞板的成膜體微管異常相關(guān)[4]。增強UV-B輻射還導(dǎo)致擬南芥葉片變黃，葉片表面積減小，葉片邊緣卷曲;根長的生長已受到抑制[5]。在其他研究中還發(fā)現(xiàn)，增強UV-B輻射可以導(dǎo)致不同類型的DNA損傷，如形成嘧啶二聚體（CPDs）、6-4光產(chǎn)物等，進而表現(xiàn)為染色體的異常分裂[6]。UV-B輻射會影響植物的生長發(fā)育、生理生化過程以至整個地球生態(tài)系統(tǒng)，并造成農(nóng)作物減產(chǎn)[7]。目前，國內(nèi)外對紫外線增強后植物的響應(yīng)及其分子機理研究不斷深入，研究材料主要有大豆[8]、小麥[9]、水稻、玉米[10]等重要經(jīng)濟（糧食）作物及其他植物。研究發(fā)現(xiàn)UV-B輻射增加將會對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生一定的影響[11-13]。

染色質(zhì)組裝因子1（chromatinassembly factor 1，CAF-1） 最先是從人類細胞中分離而來的，它由p150、 p60和 p48 這3個亞基組成， 在進化上高度保守，廣泛存在于從酵母到人類等各種生物體中[14-16]。 在DNA 復(fù)制和修復(fù)過程中， CAF-1 三聚復(fù)合體可使組蛋白 H3和H4 沉積到新合成的 DNA 上。目前， 在體外系統(tǒng)中有關(guān) CAF-1 在染色質(zhì)組裝時的功能研究有較多報道， 但其在體內(nèi)對生物發(fā)育過程影響的相關(guān)研究較少。酵母中的CAF-1 由 CAC1（chromatin assembly complex 1）、CAC2 和 CAC3 組成。研究表明，CAC基因并不影響酵母的存活， 但是其中任何一個基因的缺失都會增加酵母對紫外輻射的敏感性， 且會激活端粒 DNA 側(cè)翼基因， 使其不再沉默。 在擬南芥中， CAF-1 的同源蛋白質(zhì)有 FAS1（fasciata 1）、FAS2和 MSI1（multicopy suppressor of IRA1）。與酵母中的研究結(jié)果相似， 擬南芥中 CAF-1 同源物的敲除也沒有使其出現(xiàn)致死表型， 植物仍然能夠存活， 只是在胚后器官發(fā)生時出現(xiàn)缺陷， 如激活其頂端分生組織處的沉默基因， 導(dǎo)致莖干寬扁， 相應(yīng)的葉序和花序結(jié)構(gòu)紊亂。因此， CAF-1 能夠穩(wěn)定異染色質(zhì)， 使其中的基因保持沉默[17]。

在酵母和擬南芥中， CAF-1 敲除都沒有導(dǎo)致植物出現(xiàn)致死表型的現(xiàn)象， 似乎說明 CAF-1 對于真核生物的發(fā)育并非必不可少。然而， 近期對動物的研究卻表明， CAF-1 對動物的發(fā)育是必需的。 果蠅中，去除果蠅 dCAF-1 的最大亞基 p180， 導(dǎo)致突變體發(fā)育至幼蟲期后死亡， 去除母型 dCAF-1 p180 的活性導(dǎo)致卵子發(fā)生受阻。進一步研究發(fā)現(xiàn)， dCAF-1 對于果蠅幼蟲的核內(nèi)周期（endocycle）是必需的[17]。 在斑馬魚中， CAF-1 的中等亞基 CAF-1b 的活性降低， 導(dǎo)致細胞周期進程和細胞分化異常以及某些器官發(fā)育障礙， 特別是視網(wǎng)膜、頂蓋、胸鰭和頭骨等的發(fā)育出現(xiàn)缺陷。視網(wǎng)膜前體細胞停滯在細胞周期的 S 期， 之后這些細胞發(fā)生凋亡。由于降低 P53基因的活性可以挽救細胞凋亡但不能挽救細胞分化的缺陷， 因此， CAF-1 的活性對于這些器官中細胞周期的進程和分化起著非常重要的作用。爪蟾 p150活性的降低使得胚胎發(fā)育停滯在中囊胚過渡（MBT）之前， 表現(xiàn)為細胞周期進程異常， 說明其對 MBT 之前快速細胞周期的正常進程是必要的[17]。對哺乳動物小鼠的研究表明， 去除 CAF-1 p150 的純合突變體胚胎發(fā)育停止于 16-細胞期， 其中組成型異染色質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)嚴重改變。因此， CAF-1 對于細胞核中染色體建立正確的空間結(jié)構(gòu)是必需的。

筆者在增強UV-B輻射條件下，以擬南芥野生型Col0和突變體fas1為材料，通過分析發(fā)芽率、根長、RT-PCR、根尖分生區(qū)有絲分裂，以期探討fas1基因在擬南芥有絲分裂過程中的功能，為fas1在有絲分裂過程中的機制研究提供參考。

1 材料及方法

1.1 材料 野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana，Columbia ecotype）為植物分子與環(huán)境脅迫響應(yīng)山西省高校重點實驗室保存。fas1（At1G65470）基因的T-DNA插入突變體fas1，編號為Salk_09467，購自擬南芥資源中心NASC。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥的培養(yǎng)。

將擬南芥種子放到離心管中，加適量純凈水，4 ℃冰箱中避光春化3 d后，用1%的NaClO溶液消毒12 min，用無菌水沖洗5次，每次1 min;向離心管中加入0.1%瓊脂水使種子懸浮并點種在滅過菌的1/2 MS固體培養(yǎng)基上（2.37 g/L MS 固體粉末，1.5%蔗糖，0.8%瓊脂，pH 58～6.0）。對照組轉(zhuǎn)到22 ℃/18 ℃（光照/黑暗）、16 h光照/8 h黑暗，光照強度6 000～8 000 lx 的環(huán)境中培養(yǎng) 7 d ;UV-B脅迫處理組，參見文獻[14]的方法，具體如下：取正常培養(yǎng)的Col-0和eb1c植株為材料，從點種后第1天開始，轉(zhuǎn)移到紫外燈泡下，每天08：00～10：00在固定計量[2 W/（m2·d）]的紫外強度下處理2 h，其余時間與對照組處理相同。

1.2.2 DNA水平鑒定擬南芥fas1突變體植株。

取擬南芥基部1 cm2大小的健康葉片3～5片，液氮研磨。加400 μL Extraction Buffer混勻，65 ℃溫育10 min。加150 μL KAC（3 mol/L，pH4.8），混勻，冰浴20 min。4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min，取上清到新離心管。加等體積異丙醇，約400 μL，混勻數(shù)次，立即室溫14 000 r/min 離心5 min，棄上清留沉淀。沉淀用75%乙醇清洗，室溫14 000 r/min 離心5 min，棄上清，倒扣，晾干。加30 μL ddH2O溶解所提DNA。

根據(jù)http：//signal.Salk.edu/tdnaprimers.2.html網(wǎng)站上查到 Salk_009467的 T-DNA 插入位點信息， 設(shè)計基因特異引物fas1-LP和fas1-RP與T-DNA的LBa1.3，引物序列見表1。以基因組DNA為模板，分別以fas1-LP/fas1-RP和LBa1.3/fas1-RP為引物，以Col-0野生型和突變體擬南芥基因組DNA為模板，進行PCR擴增。采用 Easy Taq DNA 聚合酶擴增，擴增體系為20 μL：Taq DNA聚合酶0.1 μL、5×Buffer 2 μL、2.5 mmol/L dNTP 1.6 μL、10 μmol/L? fas1-LP/fas1-RP和fas1-RP/LBa1.3各4 μL、模板1 μL、ddH2O 7.3 μL。PCR反應(yīng)條件為 98 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃ 10 s，58.8 ℃ 30 s，72? ℃ 1? min 10 s，35個循環(huán)后72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測有無目的條帶。

1.2.3 RNA水平鑒定擬南芥fas1突變體植株。

采用Trizol法提取擬南芥RNA，具體如下：稱取0.1 g擬南芥葉片，液氮研磨，放入1.5 mL的離心管中，加入1 mL Trizol，劇烈振蕩15 s，靜置10 min。加入預(yù)冷的氯仿200 μL，劇烈振蕩15 s，靜置5 min。4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，液體分3層，取最上面一層，加等體積預(yù)冷的異丙醇。4 ℃冰箱放置30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清，留白色膠狀沉淀。沉淀用預(yù)冷的75%乙醇清洗2次，每次2 min，4 ℃ 7 500 r/min離心5 min。加入30～40 μL的DEPC處理水溶解，并對初步提取的RNA用NanoDrop測量濃度并跑膠。取20～50 μg 進行純化處理后加30～40 μL的DEPC處理水溶解，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以目的基因fas1擴增引物fas1-FP和fas1-RP為RT-PCR的引物，以擬南芥actin基因為內(nèi)參基因，用PrimeSTAR高保真酶進行擴增。擴增體系為20 μL： PrimeSTAR 10 μL、fas1-FP/fas1-RP各1 μL、模 板 1 μL、ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)條件為98 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃ 10 s，58.8 ℃ 5 s，72 ℃ 2 mim 30 s，35個循環(huán)后72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測有無目的條帶。

1.2.4 擬南芥種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的統(tǒng)計。

種子萌發(fā)的測定方法參照宋松泉等[18]進行。具體方法如下：將擬南芥種子點種在1/2MS培養(yǎng)基上，從第2天開始， 每24 h統(tǒng)計1次種子萌發(fā)情況。每組各統(tǒng)計100粒， 連續(xù)統(tǒng)計5 d，試驗重復(fù)3次。第3天計算各組發(fā)芽勢， 第6天計算各組發(fā)芽率，分別按以下公式進行計算：

發(fā)芽勢（Ge）=（前3 d內(nèi)供試種子的發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)）×100%

發(fā)芽率（Gr）=（前6 d內(nèi)供試種子的發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥fas1突變體植株的鑒定 由圖1可知，fas1定位于擬南芥基因組的第 Ⅰ 號染色體上，由11個外顯子和10個內(nèi)含子組成。根據(jù)TAIR（http：//www.arabidopsis.org/）提供的信息，fas1突變體的T-DNA的插入位點在第5個內(nèi)含子上，并設(shè)計合適的引物。

圖2a為fas1突變體的DNA水平鑒定的PCR結(jié)果，1、2、

3號植株為待鑒定的突變體植株，4號植株為野生型。1、2、3

號植株分別用fas1-LP/fas1-RP引物未擴增出目的條帶，如圖2 a 1、3、5所示;同時用T-DNA 邊界引物 LBa1.3/fas1-RP均擴增出目的片段，如圖2 a 2、4、6所示，表明有T-DNA 插入。4號植株為野生型（WT）植株對照，用 fas1-LP/fas1-RP引物有擴增條帶，如圖2 a 7所示;而T-DNA邊界引物L(fēng)Ba13/fas1-RP未擴增出條帶，如圖2 a 8所示，表明沒有T-DNA插入。初步表明3株苗均為fas1突變體T-DNA插入純合突變體。

圖2b為fas1突變體的RNA水平鑒定的PCR結(jié)果，1號植株為野生型，2號植株為待鑒定的fas1突變體植株。用內(nèi)參基因actin的引物擴增時，1號和2號植株結(jié)果一致，均有目的條帶，如圖2 b 1、2所示。而用fas1-LP/fas1-RP引物擴增時，1號植株擴增出2 448 bp的fas1條帶，2號植株未擴增出目的條帶，如圖2 b 3、4所示，表明2號植株有 T-DNA插入，而1號野生型擬南芥沒有 T-DNA 插入。進一步確定4號植株為fas1突變體純合植株。

2.2 UV-B處理對擬南芥發(fā)芽率和發(fā)芽勢的影響

UV-B輻射處理對擬南芥種子萌發(fā)的影響結(jié)果見表2。從表2可以看出，fas1組擬南芥的發(fā)芽勢和發(fā)芽率均低于對照組WT，分別降低了1.33%和0.66%，但是都沒有達到顯著水平（P>0.05）。在UV-B輻射條件下，WT+UV-B組擬南芥的發(fā)芽勢和發(fā)芽率都低于WT組，分別降低了12.62%和8.96%，而且都達到了顯著水平（P<0.05）;fas1+UV-B組擬南芥的發(fā)芽勢和發(fā)芽率都低于fas1組，分別降低了15.32%和10.01%，且都達到了顯著水平（P<0.05）;fas1+UV-B組擬南芥的發(fā)芽勢和發(fā)芽率都低于WT+UV-B組，分別降低了4.37%和1.80%，且都達到了顯著水平（P<0.05）。由此可知，UV-B輻射對fas1突變體發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響大于對野生型擬南芥的影響。

2.3 UV-B處理對擬南芥根長的影響

UV-B輻射處理對擬南芥根長的影響結(jié)果如圖3所示，在正常生長條件下，WT和fas1突變體擬南芥的根長差異不顯著（P>0.05）。在UV-B輻射條件下，WT+UV-B根長低于WT組，且差異顯著（P<0.05）;fas1+UV-B組擬南芥的根長低于fas1組，且達到了顯著水平;而fas1+UV-B組與WT+UV-B組的根長有差異，且達到了顯著水平。由此可知，UV-B輻射對擬南芥fas1突變體根長的影響大于對野生型擬南芥根長的影響。

2.4 UV-B處理對擬南芥根尖有絲分裂的影響

為了對UV-B輻射條件下fas1突變體的根尖有絲分裂進行觀察，對fas1突變體植株和野生型植株根尖進行DAPI染色，使用激光共聚焦觀察根尖分生區(qū)細胞的有絲分裂（圖4）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在擬南芥fas1突變體根尖分生區(qū)細胞中都有疑似異常有絲分裂現(xiàn)象的發(fā)生。

3 討論

在面對惡劣的生長環(huán)境時， 固著生長的陸生植物不能像動物那樣通過逃離來保護自己，因此它們進化出精細、有效的機制來抵抗和適應(yīng)外界各種各樣的逆境脅迫刺激。部分或全部的生長抑制是植物對極端環(huán)境的一種適應(yīng)[19]。很多與生長發(fā)育相關(guān)的重要功能基因往往也參與逆境脅迫響應(yīng)及適應(yīng)過程中的生長調(diào)整過程， fas1就是這樣一個參與細胞有絲分裂過程的重要功能基因。對fas1突變體在UV-B脅迫下表型分析和觀察根尖分生區(qū)異常有絲分裂表明，fas1基因在擬南芥發(fā)育過程中參與了UV-B脅迫反應(yīng)。

首先通過DNA和RNA水平鑒定擬南芥fas1突變體表明，與野生型相比，fas1突變體中FAS1蛋白的表達量明顯低于野生型。在UV-B脅迫條件下，fas1突變體擬南芥種子的發(fā)芽率和根長均低于野生型。之前的報道稱，當(dāng)輻射劑量高于1.0 kJ/m2時，擬南芥種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和株高、根長均受到抑制[20]。因此，fas1基因在擬南芥萌發(fā)和幼苗生長階段有重要作用。

該研究發(fā)現(xiàn)，在UV-B脅迫條件下，與野生型相比，擬南芥fas1突變體根尖分生區(qū)有絲分裂表現(xiàn)為微核和不均等分裂。而之前有報道稱，在植物fas1突變體中，根有肉眼可見的彎曲表型，且在有絲分裂后期呈現(xiàn)落后染色體。因此，fas1在擬南芥根尖分生區(qū)的有絲分裂過程中具有重要作用。

然而對fas1在植物染色體分離過程中的具體作用卻知之甚少。與此同時，fas1在UV-B條件下的功能以及fas1如何參與調(diào)節(jié)UV-B條件下染色體的分離還需要進一步的研究。

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