萌發(fā)期和苗期玉米轉(zhuǎn)海藻糖合酶基因的抗旱性研究

董春林　張彥琴　楊麗莉　梁改梅　楊睿　常建忠　趙巧紅　張明義

摘要 在PEG溶液模擬干旱條件下，研究了不同玉米品種（2個轉(zhuǎn)基因品系和各自受體對照）發(fā)芽率、傷害率、芽根比、葉片含水量、葉片SOD活性、POD活性和MDA含量，并對其在種子盒、花盆和田間的耐旱性進行了比較。結(jié)果表明，萌發(fā)期與苗期抗旱性表現(xiàn)基本一致，2個轉(zhuǎn)基因品系（T09100-3和H5T37）分別比各自受體（綜31和178）耐旱性高。

關(guān)鍵詞 轉(zhuǎn)海藻糖合酶基因;玉米;抗旱性;PEG模擬干旱脅迫

中圖分類號 S513 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）17-0028-04

Abstract Under the drought conditions simulated by PEG solution，we researched the germination rate，damage rate，shootroot ratio，leaf moisture content，leaf SOD activity，POD activity and MDA content of different maize varieties.And their drought tolerances in seed box，pot and field were compared.Results showed that the drought resistances at germination stage and seedling stage were basically the same.The two transgenic strains （T09100-3 and H5T37） showed greater drought tolerance than their own receptors （Zong 31 and 178）.

Key words Trehalose synthase gene;Maize;Drought resistence;The imitating drought stess of PEG

干旱是世界范圍內(nèi)影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要環(huán)境因子之一，它不僅影響植物的正常生長發(fā)育，造成農(nóng)作物減產(chǎn)，而且還使生態(tài)環(huán)境日益惡化[1]。創(chuàng)制作物抗旱新種質(zhì)、培育抗旱和耐旱新品種是當前作物品種改良的一個重要研究方向[2]。玉米種質(zhì)資源和品種的抗旱性鑒定和評價是抗旱種質(zhì)利用和品種改良的重要基礎(chǔ)性研究。玉米是我國第一大糧食作物，需水較多且對水分脅迫較敏感，干旱是影響玉米產(chǎn)量的重要限制因素[3]。在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高玉米抗旱性研究方面已有一些單位將海藻糖合酶基因在玉米上轉(zhuǎn)化成功[4-5]，這在一定程度上豐富了玉米種質(zhì)資源庫，但對轉(zhuǎn)海藻糖合酶基因玉米抗旱性的科學評價仍鮮見報道。鑒于此，筆者 在PEG溶液模擬干旱條件下，研究了不同玉米品種（2個轉(zhuǎn)基因品系和各自受體對照）發(fā)芽率、傷害率、芽根比、葉片含水量、葉片SOD活性、POD活性和MDA含量，并對其在種子盒、花盆和田間的耐旱性進行了比較。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試材料由山西省農(nóng)科院旱地農(nóng)業(yè)研究中心種質(zhì)資源室提供與創(chuàng)制（表1）。

1.2 試驗方法

2016年4月，用15%PEG-6000（wv）做滲透介質(zhì)，對供試材料做發(fā)芽試驗;2016年5月5日將供試材料種植于花盆內(nèi)，每盆10株，每品種各種6盆。盆體直徑35 cm、高30 cm。出苗到第5片葉完全展開期間，植株供水適量而充足，并進行以下操作：①進行離體葉片保水力測定[6];②取盆內(nèi)4個品種（轉(zhuǎn)基因品系與其受體）的帶根植株洗凈，用0、15%、25%和35%聚乙二醇（PEG）Holland營養(yǎng)液500 mL浸泡（每品種5株），模擬干旱脅迫7 d，測SOD酶活性、POD酶活性與MDA酶活性，比較酶活性的變化規(guī)律，測試前準確稱取0.1 g樣品，按照重量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例，加入9倍體積的勻漿介質(zhì)（pH 7.0的0.2 mol/L磷酸緩沖溶液），冰浴條件下制成10%的組織勻漿，3 500 r/min離心10 min后，取上清液測定;③剩余植株一半做對照繼續(xù)適量供水，另一半停水7 d進行水分脅迫，觀察植株的自然形態(tài)變化。2016年5月13日將供試材料分別在種子盒和大田播種種植，2個轉(zhuǎn)基因品系分別與各自受體分左右播于同一種子盒，觀察其出苗快慢、整齊度和苗期耐旱情況。

1.3 測定項目

用15%PEG-6000（wv）做滲透介質(zhì)，在無光照的恒溫箱內(nèi)進行高滲溶液發(fā)芽試驗，發(fā)芽溫度為（25±1）℃，以水為對照[7]，計算轉(zhuǎn)基因品系與其受體的傷害率：

傷害率= （水中發(fā)芽率-15%PEG溶液發(fā)芽率）/水中發(fā)芽率

發(fā)芽試驗后，把每個供試材料水中與滲透介質(zhì)中發(fā)過芽的種子用自來水沖洗干凈，并吸干水分，剪成芽和根2部分，在80 ℃烘箱中烘干，分別測芽干重與根干重，由此求得各自芽根干重比。

離體葉片保水力測定采用稱重法。在供水充足的植株上取3片葉靜置相同環(huán)境下，每隔一定時段稱重，計算離體葉片含水量（占自然鮮重的%）。

葉片含水量=Wf-WdWf×100

式中，Wf為葉片自然鮮重，Wd為葉片每個時段干重。

采用試劑盒法測定SOD酶活性、POD酶活性與MDA酶活性，取離心好的上清液按照試劑盒說明配液操作。

1.3.1 SOD酶活性測定?；靹蚝螅? 500 r/min離心10 min，取上清于波長550 nm處，1 cm光徑比色杯，雙蒸水調(diào)0，測定各管的吸光度。計算公式為：

SOD活力=對照OD-測定OD0.5×對照OD×反應液總體積（mL）取樣量（mL）÷勻漿液濃度（g/mL）

1.3.2 POD酶活性的測定?；靹蚝?，3 500 r/min離心10 min，取上清液于波長420 nm處，1 cm光徑比色杯，雙蒸水調(diào)0，測定各管的吸光度。計算公式為：

POD活力=測定OD-對照OD1.2×比色皿光徑（1 cm）×反應液總體積（mL）取樣量（mL）÷反應時間（30 min）÷勻漿蛋白濃度（mgmL）×1 000

1.3.3 MDA酶活性的測定?；靹蚝螅? 500 r/min離心10 min，取上清液于波長405 nm，光徑0.5 cm，雙蒸水調(diào)0，測定各管的吸光度。計算公式為：

MDA活力=271×（對照OD-測定OD）60×取樣量÷待測樣本蛋白濃度

1.3.4

出苗整齊度觀察。種子盒與大田播種后，自然狀態(tài)下觀察出苗快慢與整齊度。

1.3.5 卷葉和挺拔程度觀察。盆栽脅迫后干旱自然形態(tài)指標采用目測法于15：00記載卷葉與挺拔程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱條件下不同玉米品種發(fā)芽率和傷害率比較

以15%PEG-6000（wv）為滲透介質(zhì)來模擬干旱條件。由表1可知，2個轉(zhuǎn)基因品系與其各自受體的發(fā)芽率和傷害率與品種抗旱性關(guān)系密切。2個轉(zhuǎn)基因品系T09100-3和H5T37的傷害率分別為17.64%、37.73%;受體品種綜31和178分別為29.37%、44.44%，這表明轉(zhuǎn)基因品系萌發(fā)比各自受體需水少，且前者好捉苗、成苗率高。同時，該結(jié)果與這2個轉(zhuǎn)基因品系在種子盒與田間出苗的整齊度和快慢一致。因此，高滲溶液發(fā)芽試驗是玉米幼苗抗旱性分析和鑒定的良好指標。

2.2 干旱條件下不同玉米品種芽根比的比較 玉米籽粒萌動時，對抗旱有適應性變化，從而保證籽粒在水分脅迫條件下仍能吸收和保持一定量的水分，以滿足其自身及葉芽的需要;根為了增強抗旱能力，在萌動發(fā)芽期往往根量變化大，主要表現(xiàn)是芽根比減小。從表2可以看出，在15%PEG-6000（wv）滲透介質(zhì)模擬干旱條件下，2個轉(zhuǎn)基因品系與其各自受體的芽根比都較對照（水中發(fā)芽）低，說明供試材料在滲透介質(zhì)中發(fā)芽率均變小，而且芽根比也降低，這種形態(tài)上的變化易于抵抗逆境（如干旱與冷害）[8]。2個轉(zhuǎn)基因品系比其各自受體的芽根比低，這與2個轉(zhuǎn)基因品系在田間出苗的整齊度和快慢相一致。

2.3 不同玉米品種各時段離體葉片含水量的比較 在五葉一心期采用保水力法鑒定轉(zhuǎn)海藻糖合酶基因玉米的耐旱性。由表3可知，在充足供水條件下，不同玉米品種的含水量（占自然鮮重的百分率）之間差異較小;但隨著離體時間的延長，差異逐漸變大。不同玉米品種的離體葉片含水量下降幅度由高到低依次為綜31、T09100-3、178、 H5T37，這與盆內(nèi)脅迫一段時間后葉片表現(xiàn)出的萎蔫一致，與大田苗期的表現(xiàn)也一致。

2.4 不同PEG濃度對玉米葉片SOD活性的影響

SOD是細胞抵御活性氧傷害的重要保護性酶之一，它在清除過氧化物、H2O2 和超氧自由基，減少或阻止羥基自由基形成以保持膜系統(tǒng)免受損傷方面起重要作用。水分脅迫下植株體內(nèi)SOD活力的高低與其抗旱性密切相關(guān)，輕度或短期水分脅迫下植物 SOD 活力呈上升趨勢，而在嚴重或長期脅迫條件下呈下降趨勢[9]。該試驗結(jié)果顯示，隨著PEG濃度的增大，轉(zhuǎn)基因品系與各自受體植株體內(nèi)SOD活力均呈先上升后下降的趨勢（圖1）。在15%PEG處理下，SOD活力升高說明其積極參與活性氧的清除，而當處理濃度為25%時，綜31和178植株內(nèi)SOD活力開始降低，并且隨著處理濃度的變大，下降幅度增大;與對照相比，轉(zhuǎn)基因植株T09100-3和H5T37在PEG濃度為25%和35%時，SOD活力均仍呈上升趨勢;在PEG脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)的SOD活力顯著高于對照，說明轉(zhuǎn)基因植株具有更好的抗旱性。

2.5 PEG濃度對玉米葉片POD活性的影響 POD是植株體內(nèi)另一種重要的保護性酶，POD和CAT共同作用，將SOD酶產(chǎn)生的H2O2進一步還原為H2O。在干旱脅迫下，POD和SOD的活力變化趨勢基本相同：在脅迫初期，POD活力增加，說明適當?shù)乃置{迫能增強玉米對干旱的適應性;但隨著PEG濃度加大，POD活力開始下降，濃度為抗旱性好的品種的下降幅度小于抗旱性差的品種，因此POD是檢驗玉米抗旱性高低的標準之一。該試驗結(jié)果顯示，PEG濃度為15%時，4個材料的POD活力均上升，當濃度達到25%時，對照組的綜31和178的POD活力開始下降，濃度為35%時下降幅度變大;而對應的轉(zhuǎn)基因植株在PEG濃度為35%時仍然呈上升趨勢。因此，在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株細胞能夠更好地抵御活性氧傷害，維持其正常的生長發(fā)育。

2.6 PEG濃度對玉米葉片MDA含量的影響

丙二醛MDA是脂質(zhì)膜過氧化的主要產(chǎn)物，其含量高低反映質(zhì)膜過氧化作用強弱和質(zhì)膜破壞程度的高低。研究表明，在干旱條件下，玉米不同基因型葉片組織中MDA含量均增加，且可以根據(jù)其增加幅度來判斷抗旱性的強弱。由圖3可知，隨著PEG濃度的增大，植株葉組織中MDA的含量也逐漸增大;與對照綜31和178相比，轉(zhuǎn)基因植株T09100-3和H5T37的增加幅度明顯較小，說明在干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)質(zhì)膜過氧化程度低于對照，即其抗旱性強于對照。

2.7 不同玉米品種在種子盒、花盆和田間的耐旱性比較

2個轉(zhuǎn)基因品系與各自受體分別在種子盒與大田播種，其轉(zhuǎn)基因品系均比對照早出苗3 d，出苗整齊度較好。出苗期間田間干旱，種子盒人為蹲苗控水。從圖4、5、6可以看出，轉(zhuǎn)基因品系抗旱性明顯強于對照;從圖7、8可以看出，將2個轉(zhuǎn)基因品系與各自受體播種在花盆內(nèi)，從出苗到第5片葉完全展開時，盆內(nèi)植株供水適量且充足，灌足水后進行水分脅迫7 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因品系生長舒展挺拔，對照受體萎蔫卷曲葉片泛黃，說明轉(zhuǎn)基因品系抗旱性強于對照。

3 結(jié)論與討論

海藻糖是植物抵御各種脅迫環(huán)境的保護劑[7]，廣泛存在于酵母、藻類和一些低等維管植物中，最高含量可達10%[10]。在干燥失水等惡劣環(huán)境下海藻糖細胞表面形成獨特的保護膜，可有效地保護蛋白質(zhì)分子不變性失活，從而維持生命體的生命過程的生物特征，使生物體表現(xiàn)較強的抗旱能力[11-12]。因此，山西省農(nóng)業(yè)科學院旱地農(nóng)業(yè)研究中心利用基因槍法將海藻糖轉(zhuǎn)入綜31與178自交系，10多年來獲得一大批轉(zhuǎn)化品（株）系;該研究利用 T09100-3和H5T37品系進行了萌發(fā)期與苗期的抗旱性研究。

該試驗結(jié)果表明，采用的萌發(fā)期與苗期抗旱性研究方法結(jié)果基本一致，均證明2個轉(zhuǎn)基因品系（T09100-3和H5T37）分別比各自受體耐旱性強，該研究方法簡單且有應用價值。該試驗結(jié)果還顯示，PEG溶液模擬干旱條件下的發(fā)芽試驗葉片SOD、POD酶活性的測定均與種子盒、田間抗旱性觀察結(jié)果基本相符，這說明基因轉(zhuǎn)化過程中，在人為創(chuàng)造

的不利環(huán)境中選擇抗旱性是可行的;在PEG模擬水分脅迫條件下測定轉(zhuǎn)化品系種子發(fā)芽率、SOD酶活性、POD酶活性的變化規(guī)律以及苗期離體葉片保水力等，從而檢驗不同轉(zhuǎn)基因品系抗旱性是一種有實用價值的實驗室方法。

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