洛伐他汀對(duì)醛固酮誘導(dǎo)鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖及其iNOS-NO系統(tǒng)活性的調(diào)控作用

馮惠平，賈新未，王艷飛，張 芳，張?zhí)m芳，解俊敏

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北保定071000)

心肌成纖維細(xì)胞(CFs)增殖在心肌纖維化中起重要作用。已有報(bào)道CFs具有誘導(dǎo)型一氧化氮合酶—一氧化氮(iNOS-NO)系統(tǒng)，其合成的NO是一種重要的抗心肌纖維化因子［1］。我們的研究已證實(shí)醛固酮可下調(diào)CFs的iNOS-NO系統(tǒng)活性，與醛固酮促CFs增殖密切相關(guān)［2］。但他汀類(lèi)藥物對(duì)醛固酮誘導(dǎo)的CFs的iNOS-NO系統(tǒng)活性是否有調(diào)控作用，及其與他汀類(lèi)藥物拮抗醛固酮促CFs增殖的作用有無(wú)聯(lián)系鮮見(jiàn)報(bào)道。我們觀察了洛伐他汀干預(yù)條件下醛固酮誘導(dǎo)大鼠CFs的iNOS-NO系統(tǒng)活性的變化，旨在為心肌纖維化的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 出生2～3 d的SD大鼠18只，雌性10只，雄性8只，購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。

1.1.2 試劑 洛伐他汀、醛固酮、四氮唑鹽(MTT)、胰蛋白酶購(gòu)于Sigma公司;DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司;胎牛血清購(gòu)于天津TBD公司;TRIzol試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司;PT-PCR試劑盒購(gòu)于華美公司;iNOS mRNA和GAPDH mRNA的寡聚核苷酸引物由上海生物工程公司合成。NO和iNOS測(cè)定試劑盒為南京建成生物技術(shù)公司產(chǎn)品。波形蛋白單克隆抗體、纖維連接蛋白單克隆抗體、α肌動(dòng)蛋白單克隆抗體、SABC試劑盒為武漢博士德公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 CFs的培養(yǎng)和鑒定 在無(wú)菌條件下取出SD大鼠的心室，采用胰酶消化法和差速貼壁法分離CFs［3］。待CFs生長(zhǎng)接近融合時(shí)以1∶3傳代。采用SABC法對(duì)CFs行免疫組化染色，波形蛋白、纖維連接蛋白染色陽(yáng)性和平滑肌肌動(dòng)蛋白染色陰性鑒定為所需的CFs，純度達(dá)98%。實(shí)驗(yàn)用2～3代細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞分組 分為對(duì)照組、1×10-5mol/L洛伐他汀組(A組)、1×10-7mol/L醛固酮組(B組)、1×10-7mol/L醛固酮+1×10-8mol/L洛伐他汀組(C組)、1×10-7mol/L醛固酮+1×10-7mol/L洛伐他汀組(D組)、1×10-7mol/L醛固酮+1×10-6mol/L洛伐他汀組(E組)、1×10-7mol/L醛固酮+1×10-5mol/L洛伐他汀組(F組)、1×10-7mol/L醛固酮+1×10-5mol/L洛伐他汀+1×10-5mol/L甲羥戊酸(MVA)組(G組)、1×10-7mol/L醛固酮+1×10-5mol/L洛伐他汀+1×10-4mol/L MVA組(H組)、1×10-7mol/L醛固酮+1×10-5mol/L洛伐他汀+1×10-3mol/L MVA 組(I組)、1×10-7mol/L醛固酮+1×10-5mol/L洛伐他汀+5 μmol/L法尼酯焦磷酸(FPP)組(J組)。細(xì)胞取自同批培養(yǎng)的CFs。

1.2.3 各組細(xì)胞增殖情況觀察 采用MTT比色法。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CFs接種在96孔板中，每孔5×103個(gè)細(xì)胞，在37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng);24 h后換含1%血清DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育24 h，使細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)靜止期。棄上清液，對(duì)照組加入10%血清DMEM培養(yǎng)液，上述其他各組分別加入相應(yīng)藥物繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。于培養(yǎng)結(jié)束前4 h，加入 MTT(5 g/L)20 μL，在酶標(biāo)儀上 490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值(A490值)。

1.2.4 各組細(xì)胞iNOS-NO系統(tǒng)活性測(cè)定 CFs培養(yǎng)至近融合狀態(tài)時(shí)，1%血清DMEM培養(yǎng)液馴化24 h，分別加入10%血清DMEM培養(yǎng)液和藥物，孵育24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液。采用硝酸還原酶法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的NO含量，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。與NO含量測(cè)定同法處理細(xì)胞，通過(guò)iNOS催化產(chǎn)生的NO量推算iNOS的活力，采用分光光度計(jì)法測(cè)定吸光度值。iNOS活性以每毫升培養(yǎng)液每分鐘生成的1 nmol的NO為一個(gè)酶活力單位。公式:iNOS活性=(測(cè)定管吸光度 -空白管吸光度)×45.43 U/mL。具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.5 各組細(xì)胞iNOS mRNA檢測(cè) 采用RT-PCR法。將2～3代的心室成纖維細(xì)胞種植于50 mL培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)至亞融合狀態(tài)后，在含1%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，然后在10%血清DMEM培養(yǎng)液狀態(tài)下，加入相應(yīng)藥物作用24 h后觀察iNOS mRNA的表達(dá)。①RNA抽提及測(cè)定:TRIzol試劑盒一步法抽提細(xì)胞總RNA。引物由上海生物工程公司合成。鼠iNOS cDNA(276 bp):上游引物5'-TCGAGCCCTGGAAGACCCACATCT-3'，下游引物 5'-GTTGTTCTTCTTCCAAGGTGTTTGCCTTAT-3';GAPDH cDNA(453 bp):上游引物5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。② RT-PCR:取總 RNA 2 μg，采用 TitanTM一步法RT-PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，總反應(yīng)體積為30 μL?；靹蚝?，在熱循環(huán)儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，條件如下:95℃孵育5 min，然后分別94 ℃、1 min，55 ℃、1 min，72 ℃、1.5 min，共30 個(gè)循環(huán)。③產(chǎn)物分析:擴(kuò)增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳(含0.5 mg/L溴乙錠)，膠片經(jīng)光密度掃描，測(cè)定各條帶吸光度值，以GAPDH作內(nèi)參照，計(jì)算相對(duì)比值。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn);多組均數(shù)比較采用方差分析和兩兩比較;兩組數(shù)據(jù)相關(guān)性采用直線相關(guān)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組CFs增殖情況比較 對(duì)照組 A490值為0.208 ±0.019、A 組 0.209 ± 0.017、B 組 0.390 ±0.010、C 組 0.378 ±0.012、D 組0.356 ±0.011、E 組0.287 ± 0.008、F 組 0.231 ± 0.007、G 組 0.254 ±0.016、H 組0.339 ±0.014、I組 0.392 ±0.013、J組0.385 ±0.011。B 組與對(duì)照組比較，P ＜0.05，且與D、E、F 組比較，P 均 ＜0.01;G、H、I、J組與 F 組比較P ＜0.05 或 ＜0.01。

2.2 各組CFs的NO和iNOS活性比較 見(jiàn)表1。

表1 各組CFs的NO含量和iNOS活性比較(±s)

表1 各組CFs的NO含量和iNOS活性比較(±s)

注:與對(duì)照組比較，aP ＜0.01;與 B 組比較，cP ＜0.05，bP ＜0.01;與 C 組比較，dP ＜0.01;與 D 組比較，eP ＜0.05，fP ＜0.01;與F 組比較，gP ＜0.05，hP ＜0.01

組別 NO(μmol/L) iNOS活性(U/mL)29.43 ±3.26 5.54 ±0.67 B 組 16.62 ±1.28a 3.08 ±0.75a C 組 19.96 ±1.92b 3.99 ±0.63c D 組 25.46 ±1.74bd 4.62 ±0.62bd E 組 28.91 ±2.13bde 5.41 ±0.97bde F 組 35.56 ±1.92bdf 6.62 ±0.81bdf G 組 32.06 ±1.95g 5.40 ±0.76g H 組 21.82 ±1.75h 4.12 ±0.61h I組 16.65 ±1.44h 3.35 ±0.74h J組 17.45 ±1.56h 3.17 ±0.64對(duì)照組h

2.3 各組CFs iNOS mRNA表達(dá)水平比較 B、C、D、E、F組 CFs iNOS mRNA相對(duì)比值分別為0.297±0.008、0.374 ± 0.032、0.594 ± 0.023、0.776 ±0.063、1.027 ± 0.030，隨洛伐他汀濃度升高，iNOS mRNA表達(dá)量逐漸升高，呈劑量依賴(lài)性(P均 ＜0.05)。見(jiàn)圖1。G、H、I、J組 CFs iNOS mRNA 相對(duì)比值分別為0.804 ±0.085、0.556 ±0.035、0.309 ±0.014、0.313 ±0.017，與 F 組比較，P 均 ＜0.05，隨著MVA刺激濃度的增高，iNOS mRNA亦逐漸降低(P 均 ＜0.05)。1 ×10-3mo1/L MVA 和 5 μmol/L FPP可逆轉(zhuǎn)10-5mol/L洛伐他汀上調(diào)CFs iNOS mRNA水平的作用。

圖1 洛伐他汀對(duì)醛固酮誘導(dǎo)CFs iNOS mRNA表達(dá)的影響

圖2 MVA和FPP對(duì)洛伐他汀上調(diào)CFs的iNOS mRNA表達(dá)的影響

2.4 NO與 iNOS、iNOS與 iNOS mRNA及NO與細(xì)胞增殖的相關(guān)性 洛伐他汀干預(yù)下醛固酮誘導(dǎo)CFs的NO生成量與iNOS活性、iNOS活性與iNOS mRNA 表達(dá)均呈正相關(guān)(r分別為0.826、0.752，P 均 ＜0.01);NO 生成量與 A490值呈負(fù)相關(guān)(r=-0.908，P＜0.01)。

3 討論

CFs是心肌纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞，其增殖和膠原合成積聚過(guò)多是心肌纖維化的主要病理基礎(chǔ)［4～6］。CFs合成的NO是一種重要的抗心肌纖維化因子，NO可通過(guò)自分泌和(或)旁分泌的途徑抑制CFs增生和膠原合成，NO能夠降低體外培養(yǎng)CFs纖維連接蛋白，Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)和纖維連接蛋白合成，延緩心肌纖維化發(fā)展［6］。本研究表明，CFs具有內(nèi)源性iNOS-NO系統(tǒng)，能夠生成NO，與Gustafsson 等［1］研究結(jié)果一致。

他汀類(lèi)藥物的非降脂作用日益受到矚目，除良好的調(diào)節(jié)脂代謝作用以外，他汀類(lèi)藥物尚具有改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，穩(wěn)定斑塊，減少心肌梗死和腦卒中等心腦血管事件的發(fā)生。最近有研究［7］表明，氟伐他汀能減緩糖尿病大鼠心肌肥厚和心肌間質(zhì)纖維化，并伴有心臟收縮和舒張功能的改善;瑞舒伐他汀能減緩并抑制狗的心肌肥厚，改善左室功能［8］。他汀類(lèi)藥物延緩心肌纖維化的研究已成為新的研究熱點(diǎn)［9］，但其作用機(jī)制尚不清楚。我們的研究已證實(shí)他汀類(lèi)藥物可抑制醛固酮促CFs增殖的作用，文獻(xiàn)［10，11］報(bào)道他汀可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的eNOS，增加NO的合成，我們的研究結(jié)果同樣表明在1×10-8～1×10-5mol/L濃度范圍內(nèi)，洛伐他汀可抑制醛固酮作用增加CFs的NO含量、iNOS活性、iNOS mRNA表達(dá)，且呈劑量依賴(lài)性。

CFs的iNOS-NO系統(tǒng)中的多個(gè)因素是相互聯(lián)系，密不可分的。相關(guān)性分析表明，在洛伐他汀作用下，CFs的NO生成量的增加與iNOS活性增加呈正相關(guān)，iNOS活性的增加與iNOS mRNA表達(dá)量的增加呈正相關(guān)。洛伐他汀增加CFs的NO生成量和iNOS活性的同時(shí)，CFs的iNOS mRNA表達(dá)亦顯著增加，表明洛伐他汀在基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控CFs的iNOS-NO系統(tǒng)活性。

本研究還發(fā)現(xiàn)，MVA、FPP呈濃度依賴(lài)性拮抗洛伐他汀增加CFs NO含量、iNOS活性和iNOS mRNA表達(dá)的作用。當(dāng)加入1×10-3mol/L MVA或5 μmol/L FPP時(shí)，洛伐他汀對(duì)CFs增殖的抑制作用能被完全地逆轉(zhuǎn)的同時(shí)，洛伐他汀對(duì)CFs的NO含量、iNOS活性和iNOS mRNA表達(dá)的增加作用亦被逆轉(zhuǎn)，說(shuō)明MVA和其代謝產(chǎn)物FPP在CFs的iNOSNO系統(tǒng)的活性調(diào)節(jié)中有重要作用。這與文獻(xiàn)［12～15］報(bào)道他汀類(lèi)藥物在體外心肌細(xì)胞NO釋放能被外源加入的MVA所阻斷相一致。進(jìn)一步支持MVA途徑可能參與洛伐他汀上調(diào)醛固酮誘導(dǎo)CFs的iNOS-NO系統(tǒng)活性。洛伐他汀上調(diào)CFs的iNOSNO系統(tǒng)的活性可能是其抑制CFs增殖的作用機(jī)制之一。醛固酮誘導(dǎo)的CFs的iNOS-NO系統(tǒng)活性降低，導(dǎo)致CFs增殖，促心肌纖維化的形成。而洛伐他汀可上調(diào)醛固酮誘導(dǎo)的CFs的iNOS-NO系統(tǒng)的活性，拮抗醛固酮的促心肌纖維化作用。筆者認(rèn)為，CFs的iNOS-NO系統(tǒng)活性的變化參與了他汀類(lèi)藥物抑制醛固酮促心肌纖維化作用。但他汀類(lèi)藥物調(diào)控iNOS-NO系統(tǒng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路還有待進(jìn)一步研究。

［1］Gustafsson AB，Brunton LL.Beta-adrenergic stimulation of rat cardiac fibroblasts enhances induction of nitric-oxide synthase by interleukin-1beta via message stabilization［J］.Mol Pharmacol，2000，58(6):1470-1478.

［2］馮惠平，馮惠清，尹博英，等.醛固酮對(duì)鼠心肌成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶/一氧化氮的調(diào)控［J］.中華高血壓雜志，2010，8(8):769-773.

［3］Meszaros JG，Raphael R，Lio FM，et al.Protein kinase C contributes to desensitization of ANGⅡsignaling in adult rat cardiac fibroblasts［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2000，279(6):1978-1985.

［4］王國(guó)欽，李瑞滿，金偉，等.麥冬抑制大鼠心肌成纖維細(xì)胞膠原合成的作用及其機(jī)制［J］.中國(guó)病理生理雜志，2013，29(4):615-618.

［5］周許峰，孫維君，張義平，等.毫米波輻照對(duì)心肌成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成的影響［J］.山東醫(yī)藥，2010，50(22):27-28.

［6］Chun TY，Bloem LJ，Pratt JH.Aldosterone inhibits inducible nitric oxide synthase in neonatal rat cardiomyocytes［J］.Endocrinology，2003，144(5):1712-1717.

［7］Dai QM，Lu J，Liu NF.Fluvastatin attenuates myocardial interstitial fibrosis and cardiac dysfunction in diabetic rats by inhibiting over-expression of connective tissue growth factor［J］.Chin Med J，2011，124(1):89-94.

［8］Zacà V，Mishra S，Gupta RC，et al.Pleiotropic effects of longterm monotherapy with rosuvastatin in dogs with moderate heart failure［J］.Cardiology，2012，123(3):160-167.

［9］艾文，謝培益，陳延偉，等.阿托伐他汀對(duì)1型糖尿病心肌病大鼠心肌纖維化的作用及機(jī)制探討［J］.山東醫(yī)藥，2013，53(24):32-35.

［10］Balakumar P，Kathuria S，Taneja G，et al.Is targeting eNOS a key mechanistic insight of cardiovascular defensive potentials of statins［J］.J Md Cell Cardid，2012，52(1):83-92.

［11］Delles C，Dymott JA，Neisius U，et al.Reduced LDL-cholesterol levels in patients with coronary artery disease are paralleled by improved endothelial function:An observational study in patients from 2003 and 2007［J］.Atherosclerosis，2010，211(1):271-277.

［12］Parker RA，Huang Q，Tesfamariam B.Influence of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA(HMG-CoA)reductase inhibitors on endothelial nitric oxide synthase and the formation of oxidants in the vasculature［J］.Atherosclerosis，2003，169(1):19-29.

［13］Ongini E，Impagnatiello F，Bonazzi A，et al.Nitric oxide(NO)-releasing statin derivatives，a class of drugs showing enhanced antiproliferative and antiinflammatory properties［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(22):8497-8502.

［14］Andreadou I，F(xiàn)armakis D，Prokovas E，et al.Short-term statin administration in hypercholesterolaemic rabbits resistant to postconditioning:effects on infarct size，endothelial nitricoxide synthase，and nitro-oxidative stress［J］.Cardiovasc Res，2012，94(3):501-509.

［15］Ajamieh H，F(xiàn)arrell G，Wong HJ，et al.Atorvastatin protects obese mice against hepatic ischemia-reperfusion injury by Toll-like receptor-4 suppression and endothelial nitricoxide synthase activation［J］.J Gastroenterol Hepatol，2012，27(8):1353-1361.