蜂膠黃酮對人結(jié)腸癌細(xì)胞PDE4D及Gadd45G基因表達(dá)的影響

其曼古麗·吐爾洪，布威海麗且木·阿巴拜科日，祖麗比亞·司馬義，買熱艷木·艾爾肯，阿達(dá)萊提·麥麥提，依米提·熱合曼

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊830046)

近年研究發(fā)現(xiàn)，蜂膠中含有多種對腫瘤細(xì)胞具有抑制作用的活性成分，如黃酮類及黃酮醇類，可阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡;蜂膠黃酮(PB3A)具有一定的抗氧化活性［1］。磷酸二酯酶 4D(PDE4D)、DNA損傷誘導(dǎo)基因G(Gadd45G)分別是腫瘤生長的下調(diào)基因和上調(diào)基因，兩者在前期研究基因芯片分析中的差異表達(dá)倍數(shù)為10倍以上。PDE4D基因是環(huán)磷酸腺苷(cAMP)特異性PDE，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖作用［2～4］;Gadd45G 具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡的作用［5］，其表達(dá)缺失可致細(xì)胞的無限增殖，從而引起腫瘤發(fā)生［6］。2008年1月以來，我們觀察了PB3A對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞生長的抑制作用及PDE4D、Gadd45G表達(dá)的影響，現(xiàn)分析結(jié)果，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 結(jié)腸癌SW480細(xì)胞購自上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。RIPA-1640培養(yǎng)基購自Hyclone;胎牛血清購自Gibco;Trizol Reagent購自Invitrogen;cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自 Fermentas;PDE4D、Gadd45G及 β-actin引物、SYBR?Premix Ex TaqTMPerfect Real Time和 DEPC購自 TaKaRa公司(大連);辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG、PDE4D、Gadd45G、βactin等抗體購自博奧森生物有限公司;protein ladder、BCA蛋白定量試劑盒購自 thermo;蜂膠黃酮PB3A(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%)由依米提·熱合曼博士提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 結(jié)腸癌SW480細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)與含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中(青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日傳代，取處于對數(shù)生長期細(xì)胞分為PB3A組和對照組。

1.3 細(xì)胞干預(yù)及細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 PB3A組予100 μg/mL PB3A干預(yù)24 h，對照組不干預(yù);干預(yù)24 h倒置顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞形態(tài)變化。

1.4 細(xì)胞干預(yù)及 PDE4D、Gadd45G mRNA表達(dá)測定 取兩組對數(shù)生長期SW480細(xì)胞，經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶消化后，以每孔3×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，20 h后吸除原培養(yǎng)液，PB3A組加入含100 μg/mLPB3A 的RPMI-1640培養(yǎng)液每孔2 mL，對照組加入相同濃度的DMSO。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集兩組細(xì)胞，采用Trizol試劑提取總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，核酸蛋白快速檢測儀上檢測260、280及230 nm處吸光度，經(jīng)濃度純度測定，RNA 純度 A260/280值均為2.0～1.80，說明純度好;經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，比較28 S和18 S兩條核糖體RNA(rRNA)帶，顯色強(qiáng)度約為2∶1。

1.5 細(xì)胞PDE4D及Gadd45GcDNA檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取兩組細(xì)胞總RNA 0.5 μg，按SYBR Green Real-time PCR試劑盒說明，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法合成PDE4D及Gadd45G cDNA。引物序列:β-actin:F:5'-CATCCGTAAAGACCTC TATGCCAAC-3';R:5'-ATGGAGCCACCGATCCACA-3';PDE4D:F:5'-TCAGAGTG GTAAATTGTG TGTGAGA-3';R:5'-GGCAGAATCAACCCATGCTT-3';Gadd45G:F:5'-CGAGTCGGCCAA GTTGATGA-3';R:5'-ACCCGCACGATGTTGATGTC-3'。25 μL 反 應(yīng) 體系中含 cDNA模板1 μL，SYBR?Premix Ex TaqTM12.5 μL，上游引物 0.6 μL，下游引物 0.6 μL，ddH2O 10.3 μL。PCR 擴(kuò)增程序:95 ℃ 預(yù)變性 3 min;95℃變性10 s，65℃退火30 s，40個(gè)循環(huán);72℃延伸45 s，共61個(gè)循環(huán)，末次延伸72℃、5 min。每次擴(kuò)增均設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品組和目的基因組以及2管空白對照組(以ddH2O代替模板)。以β-actin 134 bp作為陽性內(nèi)參對照，對cDNA模板的細(xì)胞拷貝數(shù)進(jìn)行校正。擴(kuò)增效率為90%～115%。△循環(huán)閾值(Ct)=樣品 Ct均值 -內(nèi)參照 Ct均值，ΔΔCT=(CT靶基因-CT內(nèi)參)PB3A 組 -(CT靶基因-CT內(nèi)參)對照組;2-ΔΔCT為目的基因的相對總量;2-ΔΔCT＞1表示目的基因表達(dá)上調(diào)，2-ΔΔCT＜1 表示基因表達(dá)下調(diào)。

1.6 細(xì)胞干預(yù)及PDE4D、Gadd45G蛋白檢測 采用蛋白免疫印跡法。待培養(yǎng)的細(xì)胞以80%匯合狀態(tài)時(shí)，PB3A組用100 μg/mL的 PB3A干預(yù)24 h，對照組不干預(yù)。將0.25%胰蛋白酶消化的3×106個(gè)細(xì)胞用冰冷的PBS沖洗2次，加入RIPA細(xì)胞裂解液300 μL，孵育 30 min，12 000 r/min 4 ℃ 離心 15 min，取上清，用BCA法定量總蛋白，每孔上樣總蛋白量為50 μg。經(jīng)12%SDS-PAGE分離Gadd45G蛋白，8%SDS-PAGE分離PDE4D蛋白，4℃時(shí)將蛋白質(zhì)分別于90 V、100 V下轉(zhuǎn)到PVDF膜60 min，用含5% 牛血清蛋白封閉液封閉處理60 min，分別加入一抗(1∶2 000稀釋的兔抗人Rb單克隆抗體)4℃過夜;用TBST緩沖液充分漂洗后，加入二抗(1∶3 000稀釋)室溫反應(yīng)2 h，辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG顯色，用Image lab(4.0)軟件檢測兩組Gadd45G和PDE4D與內(nèi)參β-actin蛋白條帶的體積。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)變化 PB3A干預(yù)后24 h，倒置顯微鏡下見PB3A組細(xì)胞培養(yǎng)液混濁，細(xì)胞體縮小、變圓、皺縮，并出現(xiàn)折光性減弱的細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)顆粒狀物質(zhì);見圖1。對照組無明顯變化。

2.2 PDE4D及 Gadd45G mRNA表達(dá) PB3A組PDE4D mRNA表達(dá)低于對照組(P＜0.01)，兩者差異倍數(shù)為0.071;而Gadd45G mRNA表達(dá)高于對照組(P ＜0.01)，兩者差異倍數(shù)為8.11，見圖 2。

2.3 PDE4D及 Gadd45G蛋白表達(dá) PB3A組PDE4D蛋白表達(dá)低于對照組，Gadd45G蛋白高于對照組(P ＜0.01)，見圖3。

圖1 PB3A干預(yù)24 h后SW480細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化(200×)

圖2 兩組PDE4D及Gadd45GmRNA表達(dá)

圖3 兩組PDE4D及Gadd45G蛋白表達(dá)

3 討論

PB3A類具有抗腫瘤、降血脂和機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能等作用，對人體正常細(xì)胞和組織幾乎沒有毒副作用［7］，對結(jié)腸癌細(xì)胞具有抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用。PDE4D在人前列腺癌組織和細(xì)胞中PDE4D呈過度表達(dá)，用短發(fā)夾RNA(shRNA)敲除PDE4D后在體外和體內(nèi)可減少前列腺癌細(xì)胞的擴(kuò)散［3］;PDE4D過度表達(dá)可促進(jìn)人肺癌細(xì)胞增殖，而PDE4D抑制劑可抑制或沉默PDE4D表達(dá)，減少人肺腫瘤細(xì)胞的增殖和集落形成［8，9］，表明 PDE4D 是一種腫瘤細(xì)胞增殖的促進(jìn)因子。近期研究表明，用shRNA耗盡內(nèi)源性PDE4D基因可引起乳腺癌、肺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌、黑色素瘤細(xì)胞增值抑制和凋亡，但是PDE4D的缺失對相鄰正常組織和良性腫瘤幾乎沒有影響［10］;可見PDE4D基因可能是惡性腫瘤的指標(biāo)基因之一。PB3A可能通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖的促進(jìn)因子PDE4D的下調(diào)表達(dá)而發(fā)揮其抗癌活性。

研究發(fā)現(xiàn)，Gadd45G基因表達(dá)缺失可導(dǎo)致細(xì)胞的無限增殖，從而引起腫瘤的形成;相反其過度表達(dá)可使減慢體內(nèi)細(xì)胞堿基的攝取速度，抑制細(xì)胞形成克隆的能力，從而影響 DNA 的修復(fù)［11，12］;腦垂體腺瘤［13］、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、宮頸癌、肺癌和鼻咽癌［14］、胃癌、胰腺癌和結(jié)腸癌組織中Gadd45G表達(dá)降低，其機(jī)制涉及啟動(dòng)子甲基化或轉(zhuǎn)錄后修飾的改變［15，16］;Gadd45G 可通過激活 c-Jun氮末端激酶途徑而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡［17］。研究發(fā)現(xiàn)，人肝癌細(xì)胞株HepG2及結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480中Gadd45G mRNA表達(dá)增高。提示PB3A可能通過誘導(dǎo)Gadd45G基因的上調(diào)表達(dá)而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，PB3A組PDE4D mRNA及蛋白表達(dá)水平均低于對照組，Gadd45G mRNA及蛋白表達(dá)水平均高于對照組。提示兩條基因差異表達(dá)可能在結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用;PB3A可通過誘導(dǎo)PDE4D和Gadd45G基因表達(dá)而抑制SW480細(xì)胞生長，誘導(dǎo)其凋亡;但其確切的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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