藤茶提取物中二氫楊梅素的化學純化方法研究*

劉 濤，張曉敏，鄭紅艷，萬升標

（中國海洋大學醫(yī)藥學院，山東 青島 266003）

二氫楊梅素（3，5，7，3’，4’，5’-六羥基-2，3-雙氫黃酮醇，Dihydromyricenin）廣泛存在于葡萄科蛇葡萄屬植物中［1］，尤其在顯齒蛇葡萄植物的幼嫩莖葉中含量更高［2］。藥理研究表明，二氫楊梅素具有消炎、抑菌、止咳、陣痛、消脂［3］及抗脂質(zhì)、保肝護肝、抗高血壓、抗腫瘤、清除自由基、增強人體免疫力等［4］功效。文獻報道對二氫楊梅素進行衍生化亦能發(fā)現(xiàn)更好的活性化合物。Matsumoto等發(fā)現(xiàn)甲基化的二氫楊梅素對ladosporium真菌抑菌能力是二氫楊梅素的4倍［5］；二氫楊梅素乙酸酯、硬脂酸酯和月桂酸酯具有較好的抗氧化作用［6－8］；5-氟尿嘧啶乙酸與二氫楊梅素酯化衍生物對K562和K562/ADR腫瘤細胞有較強的抑制作用［9］。隨著二氫楊梅素生物活性研究和衍生化越來越受到重視，高純度的二氫楊梅素需求增加，而市售分析純二氫楊梅素價格昂貴。因二氫楊梅素有2個手性碳，故全合成方法較復雜。從天然植物中提取純化二氫楊梅素是簡單經(jīng)濟的方法。國內(nèi)外有部分研究報道利用有機溶劑提取法和大孔吸附樹脂提取法［10－11］從藤茶提取物中提取得到二氫楊梅素。而關(guān)于二氫楊梅素純化方面的研究則較少。有報道用重結(jié)晶法和層析分離法［12］制備高純度二氫楊梅素。層析技術(shù)分為吸附樹脂和高效液相制備技術(shù)等。高效液相色譜及高效逆流色譜分離法單次分離的樣品量少，而重結(jié)晶法存在試劑消耗大且收率低的缺點，因此這兩種方法均不合適工業(yè)化生產(chǎn)。目前，尚未有大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)高純度二氫楊梅素的報道。

為確定二氫楊梅素提純工藝以及藤茶提取物中組分，本文結(jié)合實驗室前期表沒食子兒茶素沒食子酸酯的化學精制方法［13］，以及二氫楊梅素多酚羥基保護基脫除難易程度設(shè)計了甲基化－去甲基化和乙?；ヒ阴；瘍蓷l純化路線，運用甲基化－去甲基化方法以較高產(chǎn)率制備了二氫楊梅素，并確定了藤茶提取物中主要成分構(gòu)成。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

藤茶提取物（二氫楊梅素純度為90%，陜西楊凌東科麥迪森制藥有限公司）；二氫楊梅素對照品（含量＞99%，Alfa公司），其余試劑均為市售分析純產(chǎn)品，除特別說明外，不經(jīng)處理直接使用。

WRX-1S型顯微熔點儀（溫度計未經(jīng)校正）；JEOL JNM-EPC 600核磁共振光譜儀（內(nèi)標為TMS）測1H，13CNMR；Q-TOF Ultima TMGLOBAL質(zhì)譜儀。

1.2 化合物的制備

1.2.1 2 -（3′，4′，5′-三甲氧基）-3-羥基-5，7-二甲氧基-色稀-4-酮（1） 在500mL反應瓶中加入 DMF（100 mL）、藤茶提取物（12g）及碳酸鉀（30g），攪拌0.5h，冰鹽浴條件下恒壓滴加碘甲烷（12mL，0.19mol），0℃反應2h后室溫反應22h。經(jīng)薄層色譜檢測反應完全后，在攪拌下將反應液倒入400mL冰水中，二氯甲烷（3×100mL）萃取，收集有機相，飽和食鹽水（3×100 mL）洗3次，蒸餾水（3×100mL）洗3次，無水硫酸鎂干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得到咖啡色固體。硅膠柱層析（V乙酸乙酯∶V石油醚＝1∶2）得到化合物1，產(chǎn)率為17.2%。mp：232～234°C；1H NMR （CDCl3，600 MHz）δ（ppm）：7.48（s，2H），6.54（d，J＝2.2Hz，1H），6.36（d，J＝2.2Hz，1H），3.98～3.92（4s，15H）；13C NMR（CDCl3，150MHz）δ：172.1，164.6，160.7，158.9，153.3，141.8，139.6，138.1，126.4，106.3，105.0，95.84，92.54，77.31，77.01，76.88，61.07，56.50，56.41，55.97.HRMS：m/zcacld for C20H20O＋8389.123 1；found：389.123 2。

圖1 二氫楊梅素的純化路線Fig.1 The purification route of dihydromyricenin

1.2.2 2 -（3’，4’，5’-三甲氧基）-2，5，7-三甲氧基-色滿-4-酮 （2） 以藤茶提取物為原料，制備方法同化合物1，產(chǎn)率8.9%。mp：86～89°C；1H NMR（CDCl3，600MHz）δ（ppm）：6.44（s，2H），6.03（d，J＝1.9 Hz，1H），5.89（d，J＝1.9Hz，1H），3.85～3.75（4s，15H），3.17（d，J＝14.3Hz，1H），3.06（d，J＝14.3Hz ，1H）；13C NMR （CDCl3，150MHz）δ（ppm）：193.24，173.55，170.77，158.92，152.60，135.89，129.02，109.52，107.81，104.71，92.73，88.58，77.37，77.16，76.95，60.78，56.09，52.22，41.79。HRMS：m/zcacld for C21H24405.154 4；found：405.154 3。

1.2.5 （2R，3R）-2-（3’，4’，5’-乙酰氧基苯基）-3，5，7-三乙酰氧基-色滿-4-酮（5） 在100mL反應瓶中加入乙酸酐（30mL，317.4mmol）、吡啶（30mL，372.7mmol），冰鹽浴冷卻至0℃，攪拌下緩緩加入藤茶提取物10g，攪拌30min后，室溫下繼續(xù)攪拌反應36h。經(jīng)薄層色譜檢測反應完全后，攪拌下將反應液倒入約50mL冰水中，二氯甲烷（20mL×3）萃取3次，分離有機相，有機相分別用稀鹽酸（20mL，0.1mol/L）和蒸餾水（20mL）各洗3次。有機相用無水MgSO4干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得到淡黃色粘稠固體。硅膠柱層析（V乙酸乙酯∶V石油醚＝1∶3）得1.9g白色晶體化合物5，產(chǎn)率為11.8%。mp：191～193℃；1H NMR（CDCl3，600MHz）δ（ppm）：7.24 （s，2H），6.79（d，J＝2.2 Hz，1H），6.60（d，J＝2.2Hz，1H），5.59（d，J＝12.1Hz，1H），5.43（d，J＝12.1Hz，1H），2.36（s，3H），2.29～2.28（3s，12H）；13C NMR （CDCl3，150 MHz）δ（ppm）：184.83，169.24，167.96，167.73，166.87，162.19，156.55，143.61，135.41，133.32，119.85，110.67，109.19，80.12，73.22HRMS：m/zcacld for C27H24573.123 9；found：573.123 40。

1.2.6 2 -（3’，4’，5’-三乙酰氧基苯基）-6-羥基-3，7-二乙酰氧基-色滿-4-酮 （6） 以藤茶提取物為原料，制備方法同化合物5，產(chǎn)率29.5%。mp：187～189°C；1H NMR （CDCl3，600MHz）δ（ppm）：11.24 （s，1H），7.24（s，2H），6.36（s，1H），6.32（s，1H），5.46（d，1H），5.40 （d，1H），2.30（s，3H），2.29（s，3H），2.28 （s，9H），2.12（s，3H）；13C NMR（CDCl3，150MHz）δ（ppm）：192.52，169.41，168.19，167.74，166.87，163.34，161.27，158.99，143.67，135.43，133.20，119.79，105.04，104.43，102.22， 80.09， 72.65， 21.30， 20.79， 20.34。HRMS：m/zcacld for C25H22553.095 3；found：553.095 0。

2 結(jié)果與討論

2.1 提純工藝的確定

本文設(shè)計了2種分離提純二氫楊梅素的工藝并進行實驗對比，制備方法線路如圖1所示。對藤茶提取物進行甲基化，用柱層析分離得到了全甲基化楊梅素1、化合物2和五甲基化二氫楊梅素3，3種產(chǎn)物極性相差較大，易用柱色譜進行分離，且運用三溴化硼脫除甲基制備二氫楊梅素的反應操作簡便、成本較低且收率高；嘗試對藤茶提取物進行乙?；?，因產(chǎn)物極性相差較小，利用柱色譜分離僅得到五乙?；錀蠲匪?和部分全乙?；錀蠲匪?。而大部分全乙?；錀蠲匪?與其他組分極性相近而無法全部分離提純，因此產(chǎn)率很低。同時在利用乙酰氯脫乙酰氧基制備二氫楊梅素實驗中發(fā)現(xiàn)，全乙?；錀蠲匪?位乙?；荒鼙怀?，因此該路線不適合制備高純度二氫楊梅素。此外本文還設(shè)計了芐基化－去芐基的純化路線，但對藤茶提取物進行芐基化后，得到的產(chǎn)物極性相近，運用柱層析無法分離得到高純度芐基化二氫楊梅素。綜上所述，選擇甲基化－去甲基化純化路線可用作制備高純度二氫楊梅素。

2.2 化合物2和化合物6的結(jié)構(gòu)確證

化合物2是全新化合物，為本文首次報道。通過與其結(jié)構(gòu)類似物2－羥基柚皮素-5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和化合物3的核磁信息對比確證［14］化合物2為2-（3’，4’，5’-三甲氧基）-2，5，7-三甲氧基－色滿-4-酮。

通過對比化合物5與化合物6的高分辨質(zhì)譜與氫譜發(fā)現(xiàn)化合物5比化合物6多一個乙?；衔?只有A環(huán)的6-H和8-H化學位移與化合物6A環(huán)的6－H和8-H化學位移不同，其余氫的化學位移相似，說明化合物6有一個酚羥基未被乙酰化；在化合物6氫譜的化學位移11.2處有一單峰，推測原因是5位羥基與4位羰基形成分子內(nèi)氫鍵，使得5位羥基氫的化學位移向低場移動，另通過與其結(jié)構(gòu)類似物2-（3’，4’-二乙酰氧基苯基）-6-羥基-3，7-二乙酰氧基－色滿-4-酮的核磁信息［15］對比確證化合物6為2-（3’，4’，5’-三乙酰氧基苯基）-6-羥基-3，7-二乙酰氧基－色滿-4-酮。

2.3 化合物3和化合物4立體構(gòu)型的確定

3 結(jié)語

本文通過甲基化－去甲基化反應制備了二氫楊梅素純品，總產(chǎn)率達到12.2%。本文從藤茶提取物中分離得到所有化合物結(jié)構(gòu)均經(jīng)熔點、核磁共振氫譜、碳譜和質(zhì)譜確認。

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