防感煎劑對H1N1病毒感染小鼠TNF-α、IL-6的影響*

徐一凱，楊珺超

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江杭州 310006）

防感煎劑系浙江省中醫(yī)院國家級名老中醫(yī)的經(jīng)驗方，主要由荊芥10g，防風(fēng)10g，前胡10g，板藍根 10g，大青葉 10g，黃芩 10g，杏仁 10g，白芷 10g，陳皮6g組成。方中諸藥寒溫并用，功能解表散寒、清熱解毒、宣肺利氣，經(jīng)長期臨床使用證實：該藥有較好的防治流感效果。前期的實驗結(jié)果顯示防感煎劑有很好的直接抑制甲1型流感病毒作用以及調(diào)節(jié)T細胞免疫功能作用[1]，可以減輕肺部炎癥損害，有利于病毒感染的控制；體外抑制試驗的研究結(jié)果表明防感煎劑可以阻止病毒吸附于易感細胞[2]。本實驗從小鼠TNF-α和IL-6細胞因子的表達入手，進一步揭示防感煎劑抗病毒感染的免疫機理。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

清潔級ICR小鼠（二級）96只，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。

1.2 實驗藥品

防感煎劑所需中藥購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房，藥物品系和質(zhì)量合格。藥材鑒定人：錢松洋，主任中藥師。按常規(guī)方法煎煮2次，將前后兩次煮液合并，過濾，所得濾液進行濃縮，最終使用藥物劑量為29.32g/kg（經(jīng)前期實驗驗證為最佳藥物濃度）[1]。實驗使用藥物劑量為29.32g/kg。磷酸奧司他韋（達菲）膠囊，75mg/粒，批號 E1284，羅氏大藥廠香港有限公司。

1.3 病毒

甲1型流感病毒鼠肺適應(yīng)株（FM1），由浙江省疾病預(yù)防與控制中心病毒所提供。經(jīng)測定，該病毒對小鼠的 LD50為 10-4/20μl。

1.4 實驗試劑

小鼠腫瘤壞死因素（TNF-α）ELISA試劑盒，批號 1207283；小鼠白介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒，批號1207281均由美國R&D公司分裝，上海西唐生物科技有限公司提供。

1.5 統(tǒng)計方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素 ANOVA，組間兩兩比較，方差齊性時用LSD-t檢驗，方差不齊時用Tamhane's T2檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 實驗方法

2.1 分組及用藥情況

小鼠按體重分層隨機分為正常對照組、模型對照組、防感煎劑組、達菲對照組，每組24只。按照體型系數(shù)換算法進行實驗動物與人用藥量的換算，防感煎劑組給藥量劑量為29.32g/kg；達菲對照組給藥劑量為0.02g/kg，正常對照組和模型組以生理鹽水灌胃，每天1次，每次0.25mL/10g，分別灌胃給藥，先正常給藥2d，第3-8天在甲1型流感病毒液滴鼻感染造模后2h灌胃給藥，共給藥8d。

2.2 造模方法

給藥第3天，小鼠用乙醚輕度麻醉后，正常對照組以生理鹽水滴鼻，其余各組以10LD50的甲1型流感病毒液滴鼻感染，每只20μL，以滴鼻造模的次日為病毒感染后第1天，每組小鼠分別于感染后第1，5，9，13 天隨機取小鼠動態(tài)觀察毛色，皮膚，反應(yīng)速度（對一般刺激）等情況。

3 結(jié)果

3.1 小鼠一般情況的變化

正常組小鼠毛色光潔，呼吸平穩(wěn)，活潑好動，反應(yīng)靈敏，飲食正常，而病毒感染的72只小鼠不久即出現(xiàn)不同程度的形體消瘦，毛色干枯，反應(yīng)遲鈍。各藥物干預(yù)組隨著藥物的應(yīng)用，癥狀明顯較模型組減輕。模型組形體消瘦，毛色枯槁，精神萎靡、反應(yīng)遲鈍，飲食減少。達菲組較模型組、防感煎劑組毛色稍潤澤，反應(yīng)稍靈敏。

3.2 RT-PCR檢測感染小鼠流感病毒含量

實時熒光定量RT-PCR檢測流感病毒含量結(jié)果顯示：第1天，第5天，防感煎劑組病毒含量低于模型對照組（P＜0.05）；第9天防感煎劑的病毒含量低于模型對照組，但沒有統(tǒng)計學(xué)上的差異（P＞0.05）；第13天防感煎劑組病毒含量低于模型對照組（P＜0.05或P＜0.01）。從表6中可以看出，感染后第5天病毒含量達到峰值，第9天起不再繼續(xù)增高，而經(jīng)防感煎劑處理后，病毒高峰仍在第5天出現(xiàn)，但無論是病毒感染初期，中期及后期病毒含量都明顯下降。見表1

表1 病毒含量 （單位：copies/μl）

3.3 血清中細胞因子的表達

3.3.1 血清TNF-α因子表達

感染后各組小鼠血清TNF-α隨時間呈升高趨勢。但在感染初期（第1天）和感染中期（第5天）各組之間TNF-α表達無明顯差異。感染后期（第9天、第13天）時模型對照組TNF-α明顯高于正常對照組（P＜0.01），防感煎劑組和達菲對照組明顯低于模型對照組（P＜0.05，P＜0.01），但兩組之間比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），與正常對照組比較也無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。提示：病毒感染后期TNF-α表達增加，防感煎劑能抑制TNF-α的表達。見表2

表2 血清TNF-α表達 （單位：pg/mL）

3.3.2 血清IL-6因子表達

感染后各組小鼠血清IL-6隨時間呈升高趨勢。但在感染初期（第1天）和感染中期（第5天）各組之間IL-6表達無明顯差異。感染后期（第9天、第13天）時模型對照組IL-6明顯高于正常對照組（P＜0.01），防感煎劑組和達菲對照組明顯低于模型對照組（P＜0.05，P＜0.01），但兩組之間比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），與正常對照組比較也無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。提示：病毒感染后期IL-6表達增加，防感煎劑能抑制IL-6的表達。見表3。

表3 血清IL-6表達 （單位：pg/mL）

4 討論

流感是由流行性流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。流感病毒發(fā)病率高、傳染性強、致死率高，其中甲型流感病毒的抗原變異性最大，曾3次導(dǎo)致世界性大流行的流感[3]。其中感染人類并能夠引起一定范圍流行的甲型流感病毒包括甲1（H1N1）和甲3（H3N2）型[4]。病毒感染機體后，可啟動宿主免疫應(yīng)答，形成炎癥反應(yīng)和炎癥免疫病理損傷。在免疫病理損傷過程中，涉及多種免疫細胞和細胞因子，而中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)機體和細胞免疫方面有明顯的優(yōu)勢，現(xiàn)代的中藥研究顯示[5]，有些中藥可直接滅活或抑制病毒，有些中藥則通過誘生干擾素或調(diào)節(jié)人體免疫功能而發(fā)揮間接抗病毒作用。而復(fù)方中藥，其有效成分多，能從多環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)機體的細胞免疫，因而能為病毒感染過程中引起炎癥免疫病理性損傷的治療提供新的研究思路。

研究發(fā)現(xiàn)激活的巨噬細胞，能增強促炎性細胞因子的分泌，包括IL-6和TNF-α[6-7]。而IL-6，TNF-α等炎性細胞因子通過趨化、活化淋巴細胞、中性粒細胞等，產(chǎn)生免疫病理損傷；另一方面，這些細胞因子可直接作用于細胞、微血管等，造成組織損傷[8]。實驗結(jié)果表明防感煎劑能明顯改善小鼠一般狀況，降低小鼠肺組織中H1N1病毒含量，抑制TNF-α、IL-6等炎性細胞因子的表達，并且與達菲組比較效果相當(dāng)。說明防感煎劑可抑制H1NI病毒復(fù)制，在病毒感染引起的免疫病理損傷過程中發(fā)揮作用，通過抑制細胞因子TNF-α、IL-6的表達，從而減輕由炎性介質(zhì)過度釋放引起的免疫病理損傷，從而來控制感染、改善癥狀。

[1]汪玉冠，宋康，駱仙芳，等.防感煎劑對甲1型流感病毒感染小鼠T細胞亞群及活化的影響 [J].中國中醫(yī)藥科技，2012，19（1）：22-24.

[2]宋康.防感煎劑含藥血清體外抑制甲1型流感病毒作用的實驗研究[C].第十次全國中西醫(yī)結(jié)合防治呼吸系統(tǒng)疾病學(xué)術(shù)研討會，2009.

[3]Carolien E.van de Sandt，Joost H.C.M.Kreijtz，Guus F.Rimmelzwaan.Evasion of Influenza A viruses from Innate and Adaptive Immune Responses[J].Viruses，2012 September，4（9）：1438-1476.

[4]WHO.Influenza（seasonal）fact sheet N°211.[EB/OL].[2009 April].http：//www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/index.html.

[5]黃海英，宋輝.抗流感病毒中藥研究進展[J].實用中醫(yī)藥雜志，2012，28（5）：439-440.

[6]van Riel D. ，Leijten L.M.，van der Eerden M.Highly pathogenic avian influenza virus H5N1 infects alveolar macrophages without virus production or excessive TNF-alpha induction[J].PLoSPathog，2011，7：e1002099.

[7]Becker S.，Quay J.，Soukup J.Cytokine（tumor necrosis factor，IL-6，and IL-8）production by respiratory syncytial virus-infected human alveolar macrophage[J].Immunol，1991，147：4307-4312.

[8]Campbell D.J.，Koch M.A.Phenotypical and functional specialization of FOXP3+regulatory T cells[J].Nat.Rev，2011（11）：119-130.