中醫(yī)藥治療β-地中海貧血的表觀遺傳學研究＊

程艷玲，吳志奎

(中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院，北京 100053)

1 β-地中海貧血的發(fā)病機理

1.1 β-地中海貧血是常染色體單基因遺傳性疾病

β-地中海貧血是世界上發(fā)病率較高的常染色體單基因遺傳性疾病，其發(fā)病機理是位于11號染色體上控制β-珠蛋白鏈合成的基因缺失或突變，導致機體不能正常合成β-珠蛋白鏈。正常人體β-珠蛋白基因簇由分布在11號染色體中部的調控區(qū)及功能區(qū)構成，調控區(qū)主要為β-LCR，其功能基因按5'ε-Gγ-Aγ-δ-β 3'排列，每條染色體上只有 1 個 β-珠蛋白基因(見圖1)。

圖1 人體不同時期的珠蛋白表達［1］

1.2 γ-珠蛋白與β-珠蛋白的生理作用比較

γ-珠蛋白較β-珠蛋白有稍微高的氧結合力，用γ-珠蛋白替代β-珠蛋白的個體同樣表現出健康的狀態(tài)。β-地中海貧血尚無法根治，目前較為普遍的治療方法主要是常規(guī)輸血和規(guī)律使用除鐵劑以及相應的對癥處理，骨髓和干細胞移植由于配型和髓源限制，很難在臨床上普及，基因治療雖然是未來的治療方向，但同源重組問題仍未解決，臨床應用尚待時日。

2 表觀遺傳修飾

近年來隨著科學技術的進步，除結構基因外，基因外編碼即表觀遺傳學愈來愈引起科研工作者的廣泛關注，已發(fā)現表觀遺傳學因素在地中海貧血的發(fā)生中起到重要作用。

2.1 表觀遺傳學的發(fā)展

1939年，生物學家Conrad.H.Waddington首先在《現代遺傳學導論》中提出了epigenetics這一術語。1942年，他在研究基因型產生表型的過程中，把表觀遺傳學描述為1個控制從基因型到表現型的機制［2，3］。1975 年，Holliday.R 對表觀遺傳學進行了較為準確地描述，認為表觀遺傳學不僅在發(fā)育過程中，還在成體階段研究可遺傳的基因表達改變，這些信息可經有絲分裂、減數分裂在細胞和個體間世代傳遞［4］。

2.2 表觀基因組學與經典DNA編碼遺傳學的區(qū)別與聯(lián)系

經典基因組遺傳學是基于基因序列改變所致基因表達水平變化(如基因突變、基因丟失等);表觀遺傳學則是基于非基因序列改變所致基因表達水平變化，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾(甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化等)以及非編碼微小RNA作用［5］。經典基因組學具有高度穩(wěn)定性的特點;表觀基因組學在一定條件下是可逆的，處于亞穩(wěn)定狀態(tài)并受多種因素影響，表觀遺傳在人體不同部位組織中并不相同，隨著年齡的增長發(fā)生變化，容易受到外界環(huán)境因素的影響［6］。越來越多的證據表明，人類表觀遺傳學模式受到環(huán)境因素的影響，如吸煙、營養(yǎng)狀況、嗜酒、環(huán)境污染、壓力等，且表觀遺傳改變具有可遺傳性。

表觀遺傳學在DNA向RNA轉錄并翻譯為蛋白質的過程中起非常重要的作用，遺傳調控(包括基因轉錄、加工、翻譯、翻譯后修飾)與表觀遺傳調控共同參并貫穿生命整個過程，使機體能夠協(xié)調運轉［4］。

遺傳信息提供合成生命必需的蛋白質模板，而表觀遺傳信息則提供何時、何地以及如何應用遺傳信息的指令，兩者既相互區(qū)別又相互依存。

3 表觀遺傳學與β-地中海貧血內在聯(lián)系研究

3.1 DNA甲基化(DNA methylation)與β-地中海貧血

DNA甲基化是指甲基化酶(methylase，DNMTS)從諸如葉酸和維生素B12等基本營養(yǎng)成分中取得甲基后，轉移到DNA序列中的堿基上，使之發(fā)生甲基化作用［8］。人類 DNA甲基化通常是在胞嘧啶(cytosine)堿基5'位碳原子上引入甲基(CH3-)，胞嘧啶由此被修飾為5甲基胞嘧啶(5 mC)從而改變DNA大分子空間構象，影響基因表達。對人類β-珠蛋白基因簇中ε、γ、β各基因在個體發(fā)育不同階段的DNA甲基化研究發(fā)現，當ε、γ、β基因分別在卵黃囊、胎兒肝臟、成人骨髓造血階段表達時，各表達基因的啟動子區(qū)DNA呈低甲基化狀態(tài)，其他沉默基因啟動子區(qū)DNA呈高甲基化狀態(tài)，即DNA甲基化抑制珠蛋白表達，而去甲基化則能夠使珠蛋白基因表達轉錄增強。

3.2 組蛋白共價修飾作用與β-地中海貧血

組蛋白的共價修飾可通過影響蛋白質與DNA雙鏈的親和性，從而改變染色質的松散和凝集狀態(tài)。組蛋白修飾的機制主要有:其一，能改變組蛋白的電荷，從而改變組蛋白與DNA結合的特性;其次，組蛋白修飾能夠募集專一蛋白復合到它們表面，從而發(fā)揮作用。

3.2.1 組蛋白甲基化作用 組蛋白甲基化作用是在組蛋白甲基轉移酶(HMTS)催化作用下完成的，組蛋白甲基化是可逆的，且甲基化標記基因的表達調控作用可以完全相反，主要取決于甲基化的位點和甲基化的程度。

3.2.2 組蛋白乙?；饔?組蛋白乙酰化作用主要由組蛋白乙?；D移酶(HATS)和組蛋白去乙?；D移酶(HDATS)協(xié)調進行。組蛋白乙?；D移酶(HATS)主要在H3、H4的賴氨酸上加乙?；?，而組蛋白去乙?；D移酶(HDATS)作用正好相反。組蛋白乙酰化與去乙?；舜酥g相互作用，而這些修飾作用都能夠改變基因的轉錄過程。對表達胎兒γ-珠蛋白基因的K562細胞表觀遺傳修飾分析顯示，從基因座位調控區(qū)到胚胎、胎兒基因都存在廣泛乙酰化，研究表明珠蛋白乙?；梢源龠Mγ-珠蛋白的合成。

3.3 β-LCRs調控區(qū)域與β-珠蛋白基因表達關系

β-珠蛋白基因的正常表達受其相應位點調控區(qū)域(β-LCR)的作用，該調節(jié)控制區(qū)域由4個紅細胞生成特異性脫氧核糖核苷酸酶高敏位點(HS1、HS2、HS3、HS4)組成，研究表明在β珠蛋白基因轉錄時，LCRs區(qū)域與功能基因的位置距離更加接近，而與胚胎期表達的ε基因以及胎兒期表達的γ-基因相距較遠(見圖2)。

圖2 β-LCRs調控區(qū)域位置變化［9］

3.4 紅系轉錄因子與表觀遺傳學修飾作用

紅系轉錄因子GATA-1、NF-E2是紅細胞轉錄因子的重要部分，在血紅蛋白生成和珠蛋白基因調控中都起重要作用，且GATA-1、NF-E2能夠誘導珠蛋白修飾。

此外，研究較多的還有BCL11A、KLF(EKLF)以及C-Myb。研究表明，BCL11A能夠抑制γ-珠蛋白合成，在成人體內高表達，但在胚胎或胎兒期則處于低水平狀態(tài);KLF能激活β-珠蛋白基因抑制γ-珠蛋白基因，激活γ-珠蛋白沉默因子BCL11A;c-Myb通過KLF1激活BCL11A途徑抑制珠蛋γ-白表達(見圖3)。

圖3 影響γ-珠蛋白鏈基因的網絡模式圖［1］

3.5 非編碼RNA(Non-coding RNAs)的表觀遺傳修飾

非編碼RNA是指不能翻譯為蛋白的功能性RNA分子，分為看家非編碼RNA和調控非編碼RNA，其中具有調控作用的非編碼RNA按其大小主要分為兩類:短鏈非編碼 RNA(包括 siRNA、miRNA、piRNA)和長鏈非編碼 RNA(lncRNA)［10～12］。

miRNA是新近發(fā)現的一類單鏈非編碼RNA，具有高度保守性、時序表達和組織表達特異性，通過對靶mRNA的降解和翻譯抑制而在動物和植物中起著重要的調控作用，屬于廣義的表觀遺傳學范圍。miRNA可通過調節(jié)DNA甲基化轉移酶、維持細胞中DNA甲基化水平或改變組蛋白修飾、染色體結構等途徑調控表觀遺傳，如一些miRNA抑制組蛋白脫乙?；傅谋磉_［13］。

4 表觀遺傳學治療β-地中海貧血研究

目前針對β-地中海貧血的表觀遺傳學治療主要集中在重新激活成人體內γ-珠蛋白鏈基因，γ-鏈的增加可降低血紅蛋白表達不平衡帶來的危害，使γ-珠蛋白替代缺失的β-珠蛋白鏈，平衡相對過剩的α-珠蛋白鏈，從而減少紅細胞損傷和臨床并發(fā)癥。人γ-珠蛋白基因的激活表達是目前治療這類疾病的重要策略，使用的藥物主要包括以下兩類［8］。

4.1 DNA甲基酶抑制劑

主要有5-氮胞苷(5-azacytidin)和地西他濱(Decitabin，5-氮胞苷因其有較強的骨髓毒作用，臨床應用受到限制;地西他濱是目前已知最強的DNA甲基化特異性抑制劑，能夠通過阻斷DNA甲基化從而激活基因轉錄。

4.2 組蛋白去乙酰化酶抑制劑

主要有丁鹽酸，丁鹽酸能夠促進γ-珠蛋白基因表達是基于促進組蛋白修飾，通過降低γ-珠蛋白基因的DNA甲基化水平、增強紅系轉錄因子GATA-1表達發(fā)揮作用。組蛋白去乙酰酶抑制劑苯丁酸鈉(PB)能明顯抑制白血病細胞Kasumi-1的生長。其次有Apicidin，一類環(huán)化四胎類物質，最初作為抗真菌藥物開發(fā)。Apicidin能夠結合組蛋白去乙酰化酶(HDAC)，競爭性結合組蛋白去乙?；福菇M蛋白過度乙?；?。臨床發(fā)現，Apicidin在誘導K562細胞向紅系方向轉化時，K562細胞中H3、H4高度乙酰化并伴隨著γ-基因mRNA表達水平升高。

5 中醫(yī)藥治療地中海貧血表觀遺傳學機理研究

中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院分子生物實驗室吳志奎教授課題組根據“腎藏精生髓，髓生血”理論創(chuàng)制了“益髓生血顆?！庇脕碇委煹刂泻Ｘ氀R床上取得了可重復的療效。大量臨床基礎實驗結果提示其療效的可能分子機制是［14］:補腎益髓中藥治療β-地中海貧血不改變患者的基因突變型，能明顯提高珠蛋白鏈γ-/γ-+β的比值，促進γ-珠蛋白mRNA的轉錄和表達，誘導HbF合成，從而代替了由于β-珠蛋白基因缺失導致的功能缺陷，平衡相對過剩的α-珠蛋白鏈，緩解臨床癥狀和減少并發(fā)癥。

復旦大學附屬華山醫(yī)院沈自尹教授就該課題組的研究作了如下評價:本研究首次在國際上用藥物對單基因遺傳病實現不是改變基因結構，而是修飾、調節(jié)基因表達與基因產物功能獲得無副作用和后遺癥的顯著療效［15］。

5.1 益髓生血顆粒對不同發(fā)育階段小鼠血紅蛋白珠蛋白表達的影響研究

吳志奎課題組發(fā)現在小鼠的紅系發(fā)育過程中，只存在胚胎(βh1，ε)→成年(βminor，βmajor)珠蛋白開關，與人β-珠蛋白基因存在從胚胎(ε)→胎兒(γ)→成人(β)2個基因開關不同，小鼠胎肝和骨髓時期都屬于紅系發(fā)育的成年期。開始胎肝造血時(孕11 d左右)，小鼠βminor珠蛋白基因的表達占主導地位，在發(fā)育過程中其表達水平逐步降低，而βmajor珠蛋白基因的表達量相應增加并最終占絕對優(yōu)勢。從這一角度來看，βminor基因與人的珠蛋白基因相似。實驗結果也顯示，隨著小鼠胚胎的發(fā)育，正常對照組的孕鼠(孕14 d)、胎鼠(孕21 d)和成年鼠中βminor珠蛋白基因的表達逐漸降低;而經中藥干預后，對照組胎鼠(孕21 d)珠蛋白程序性表達有所改變，其表達量顯著升高(P＜0.05);而正常成年鼠經中藥干預后，βminor珠蛋白基因表達量也明顯升高(P＜0.01)。這一結果與臨床研究存在高度一致。由此說明，中藥治療β-地中海貧血的分子機制之一是可以通過激活已關閉的γ-珠蛋白基因，表達γ-珠蛋白，促進HbF的生成，緩解因為β-珠蛋白生成障礙所致的正常血紅蛋白生成不足，使患者的貧血情況得到改善［16］。

5.2 從基因修飾的DNA甲基化水平研究補腎生血藥作用的分子機理

吳志奎課題組用3H-SAM甲基摻入測定DNA甲基化酶活力，用HPLC分析鼠肝DNA堿基，用3HUTP摻入測定不同甲基化水平DNA模板的體外轉錄水平。結果表明，DNA甲基化酶活力和甲基化水平隨增齡而降低，而體外轉錄與鼠齡呈正相關，補腎生血藥能明顯提高老齡大鼠肝DNA甲基化酶活力和甲基化水平，能提高鼠腦DNA甲基化酶活力，提高該酶對熱穩(wěn)定性和對鹽的耐受性［17］。

5.3 益髓生血顆粒對紅系作用因子的作用

吳志奎課題組在對中藥治療對β-珠蛋白基因簇位點調控區(qū)高敏位點2與核蛋白結合作用的影響研究中發(fā)現，中藥可能改變β-珠蛋白基因簇反式作用因子GATA的表達，使其和轉錄調節(jié)蛋白的結合模體GATA盒的結合作用發(fā)生改變，從而改變β-珠蛋白基因簇的表達、誘導γ-珠蛋白基因表達、HbF合成增加起到治療作用［18］。

5.4 疾病的環(huán)境因素與表觀遺傳學調控

吳志奎課題組在對廣西高發(fā)地區(qū)病人的多次觀察中還發(fā)現，地中海貧血患者夏季貧血癥狀加重，冬季病情則相對較輕［19］。這種疾病的季節(jié)性差異是否與環(huán)境因素改變其內在的表觀調控因素有關尚需進一步探討研究，如果該假說成立，也可以從側面解釋氣候對于人體以及疾病影響的可能機制。

6 研究展望

對于地中海貧血的表觀遺傳學治療主要集中在激活關閉的γ-基因，但影響γ-基因轉錄表達γ-珠蛋白的各種表觀遺傳因素的作用機制尚需進行更深入的探討［20］，只有對其各影響因素相互作用的網絡結構有清晰的認識，對β-地中海貧血的治療才能有更進一步的進展。

自2003年表觀基因組學計劃(Human epigenome project，HEP)實施以來，有關表觀遺傳研究的各種方法開始不斷出現，具有代表性的是DNA甲基化技術的發(fā)展，主要包括依賴于甲基化敏感的限制性內切酶技術，依賴于DNA序列分析的檢測技術和依賴于甲基化芯片、質譜的檢測技術，除上述方法外，表觀基因組學的研究方法還有高效液相色譜(HPLC)、MBD 柱層析法等［21，22］。隨著研究的不斷深入和分子生物學技術的飛速發(fā)展，必將涌現出更多較為完善的研究方法，從而為表觀遺傳學及表觀基因組學的發(fā)展以及為揭示生命現象的本質提供強有力的技術支持。

目前表觀遺傳學的研究仍然面臨著很多問題，表觀遺傳學變化與環(huán)境以及疾病之間具有怎樣的內在作用聯(lián)系，各種表觀遺傳機制之間的內在聯(lián)系以及它們之間的相互影響作用機制仍然需要深入探討，隨著科學技術的進步表觀遺傳作用對疾病的影響正逐步被揭示［23］。

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