腎去交感支配對心肌梗死后大鼠心肌纖維化和轉(zhuǎn)化生長因子-β1的影響

鄭曉新 侯果 邱璇 蔣學俊

基礎(chǔ)研究

腎去交感支配對心肌梗死后大鼠心肌纖維化和轉(zhuǎn)化生長因子-β1的影響

鄭曉新 侯果 邱璇 蔣學俊

目的 探討腎去交感神經(jīng)術(shù)（RSD）對心肌梗死大鼠心肌纖維化和轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）表達水平的影響。方法 52只雄性SD大鼠隨機分為4組：正常對照組（Control組）、腎去交感組（RSD組）、心肌梗死組（MI7d+Sham組）和腎去交感干預(yù)組（MI7d+RSD組）。MI7d+Sham組和MI7d+RSD組分別給予前降支冠脈結(jié)扎術(shù)制備心梗模型，7 d后行腎交感假手術(shù)或去交感術(shù)。心臟彩超評估大鼠左心室收縮末期直徑（LVESD）、左心室射血分數(shù)（LVEF）和左心室短軸縮短率（LVFS）。Masson法檢測大鼠左心室心肌膠原容積分數(shù)（CVF）。RT-PCR法和Western-blot法分別檢測大鼠左室心肌TGF-β1 mRNA和TGF-β1蛋白的相對表達水平。結(jié)果 與MI7d+Sham組相比，MI7d+RSD組大鼠LVESD明顯減小［LVESD（3.13±0.25）mm比（5.23±0.15）mm，P＜0．01］，而 LVFS 和 LVEF 均增高［LVFS（38.2±4.5）%比（23.1±3.3）%，P＜0．01；LVEF（61.7±1.3）%比（40.4±2.7）%，P＜0．01］。與 MI7d+Sham 組相比，MI7d+RSD 組膠原容積分數(shù)減少［（42.66±7.55）%比（59.33±9.79）%，P＜0．01］，TGF-β1 mRNA（1.47±0.09 比 2.00±0.09，P＜0.01) 和 TGF-β1 蛋白（0.46±0.04 比0.73±0.02，P＜0．01）的相對表達量均減少。結(jié)論 腎去交感神經(jīng)術(shù)能抑制心肌梗死大鼠心肌纖維化并改善心功能，可能與下調(diào)TGF-β1的表達有關(guān)。

腎去交感支配； 心肌梗死；心肌纖維化； 轉(zhuǎn)化生長因子-β1

心肌梗死（myocardial fibrosis，MI）導(dǎo)致的心力衰竭死亡率較高[1]，主要發(fā)病機制之一為心肌病理性重構(gòu)，表現(xiàn)為心肌間質(zhì)纖維化、心肌細胞肥大和凋亡，最主要的是間質(zhì)纖維化。心肌纖維化主要特點是心肌細胞外基質(zhì)沉積，如膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ、彈力蛋白等，導(dǎo)致心臟僵硬度增加，最終影響心臟收縮和舒張功能[2]。交感神經(jīng)系統(tǒng)（sympathetic nervous system，SNS）及腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（rennin-angiotensin-aldosterong system，RASS）的過度激活是導(dǎo)致心肌纖維化和心室重構(gòu)的重要因素[3]。

腎臟和心臟組織在全身交感激活后釋放的去甲腎上腺素占總量的50%以上，提示腎臟交感神經(jīng)激活在全身交感神經(jīng)興奮中的重要作用。腎交感激活后，腎臟傳入神經(jīng)可誘導(dǎo)包括心臟、中樞神經(jīng)和其他臟器交感神經(jīng)激活，進一步導(dǎo)致去甲腎上腺素釋放增加、RASS系統(tǒng)激活[4]。據(jù)此推測，腎臟交感神經(jīng)激活在心肌梗死后心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要。

腎去交感術(shù)（renal sympathetic denervation，RSD）主要原理是去除腎動靜脈周圍的傳入和傳出神經(jīng)，通過下丘腦中樞神經(jīng)反饋機制，有效降低病理狀態(tài)下的全身交感活性[5]。SYMPLICITY HTN系列研究表明，RSD在難治性高血壓治療方面有一定作用[6]。而Reach-pilot實驗則提示，RSD可明顯改善心衰患者的心功能[7]。以上作用均可能與抑制交感系統(tǒng)過度激活相關(guān)。此外，RSD用于治療慢性交感神經(jīng)激活引起的相關(guān)心血管疾病，如心肌梗死后心臟重塑、心力衰竭左心室肥厚等有較大潛力[8]。目前RSD對心肌梗死后心肌纖維化的影響及其作用機制尚不清楚，本實驗通過心肌梗死大鼠模型來探討該問題，為RSD治療心梗后心肌纖維化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料 60只成年雄性SD大鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物中心，體重180～200 g，飼養(yǎng)于自然光暗環(huán)境，室溫為（23±2）℃，標準條件飼養(yǎng)動物。所有有關(guān)動物操作方法均遵守武漢大學動物倫理委員會規(guī)程。

1.2 實驗分組 大鼠隨機分為4組：Control組（n=10）、RSD 組 （n=12）、MI7d+Sham 組 （n=15）和MI7d+RSD組（n=15）。Control組大鼠不做任何處理；RSD組大鼠給予腎動靜脈去交感處理；MI7d+Sham組和MI7d+RSD組大鼠分別給予前降支冠脈結(jié)扎術(shù)制備心梗模型，7 d后行腎動靜脈去交感假手術(shù)和去交感術(shù)處理。

1.3 腎去交感模型的建立 造模前腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉動物，備皮，消毒，鋪巾。參照Hu等[9]的方法，分離腎動靜脈，解剖顯微鏡下（×25）離斷所有可見的神經(jīng)纖維，并用10%苯酚乙醇溶液涂抹腎動靜脈，充分去除腎交感。采用腎神經(jīng)電刺激的方法評估是否徹底去除腎交感神經(jīng)。術(shù)中嚴格無菌操作，術(shù)后青霉素8萬U/d腹腔注射，連用3 d，預(yù)防感染。

1.4 心肌梗死模型的構(gòu)建 造模前腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉動物，手術(shù)期間氣管插管呼吸機輔助呼吸。備皮，消毒，鋪巾，沿胸骨左緣在第4～5肋間做一縱向切口，在距前降支開口處2～3 mm處用6號線結(jié)扎冠脈，心梗區(qū)域變蒼白，心跳減弱?？p合傷口，動物復(fù)蘇后每天肌注40萬U青霉素，連續(xù)3 d，預(yù)防感染。

1.5 超聲多普勒測定 心肌梗死造模結(jié)束4周后，應(yīng)用多普勒超聲分別測量各實驗組大鼠心臟左心室收縮末期直徑（LVESD）、左室短軸縮短率（LVFS）和左室射血分數(shù)（LVEF）。

1.6 心肌膠原容積分數(shù)（collague volume fraction，CVF）測定 超聲檢查后，過量麻醉安樂死處死動物，分離左心室并在垂直于長軸中點處將左室分成兩部分，心底部立即放置于-80℃冰箱用于生化分析，心尖部置入10%甲醛固定，用于行Masson染色。采用Image-pro plus分析軟件計算心肌膠原體積分數(shù)（CVF）。CVF=膠原纖維面積/視野總面積。每張切片選取5個視野，計算平均值。

1.7 RT-PCR檢測心肌組織中TGF-β1的mRNA表達水平 從GenBank中查閱基因序列，根據(jù)引物設(shè)計原則，利用Primer 5.0軟件引物設(shè)計。TGF-β1引物上游序列：5′-CACTCCCGTGGCTTCTAGTG-3′，下游序列 5′-GGACTGGCGAGCCTTAGTTT-3′，退火溫度為58℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)過含0.5 mg/L Goldview的2%瓊脂糖凝膠電泳，采用ZF型紫外透射反射分析儀照相，采用Quantity Onev4.6.2軟件定量分析，以目的基因吸光度（A）與內(nèi)參GAPDH的比值表示其表達水平。

1.8 Western-blot法檢測心肌組織TGF-β1蛋白表達 按照Limana等[10]的方法提取心肌組織總蛋白。取含50 g總蛋白的樣品進行非連續(xù)SDSPAGE電泳分離蛋白，并將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉，一抗孵育過夜、漂洗。辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗在37℃下孵育3 h，洗膜，加入電化學發(fā)光液（ECL）底物并曝光，圖像分析系統(tǒng)半定量分析，GAPDH作為參照，計算各組樣品蛋白相對表達水平。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13．0軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均以±s表示，對所有數(shù)據(jù)進行方差齊性和正態(tài)性檢驗，多組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析，兩兩數(shù)據(jù)比較采用SNK-q檢驗。以P＜0．05代表差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各實驗組動物基本情況 Control組大鼠全部存活，RSD組大鼠死亡3只，MI7d+Sham組大鼠死亡5只，MI7d+RSD組大鼠死亡6只，死亡原因考慮主要為嚴重心力衰竭、術(shù)后出血或感染。余下動物存活至實驗終點。

2.2 各實驗組大鼠超聲檢測結(jié)果 與RSD組相比，MI7d+Sham組心功能下降，表現(xiàn)在LVESD值增加，LVFS、LVEF 值降低［LVESD（5.23±0.15）mm 比（2.20±0.20）mm，P＜0．01；LVFS（23.1±3.3）%比（48.3±4.3）%，P＜0．01；LVEF（40.4±2.7）%比（75.2±2.6）%，P＜0．01］。與 MI7d+Sham 組相比，MI7d+RSD 組心功能改善，LVESD 值減?。郏?.13±0.25）mm 比（5.2±0.15）mm，P＜0．01］，LVFS、LVEF 值增加［LVFS（38.2±4.5）%比（23.1±3.3）%，P＜0．01；LVEF（61.7±1.3）%比（40.4±2.7）%，P＜0．01］。見圖 1。

2.3 各實驗組大鼠心肌組織Masson染色及CVF檢測結(jié)果 正常心肌組織呈紅色，纖維化組織呈藍色。Control組及RSD組心肌無明顯膠原沉積，MI7d+Sham組大鼠Masson染色藍染面積較RSD組顯著增加［（59.33±9.79）%比（4.62±0.23）%，P＜0．01］，RSD 干預(yù)后（MI7d+RSD 組）顯著減少這種增加趨勢 ［（42.66±7.55）%比 （59.33±9.79）%，P＜0．01］。見圖 2。

2.4 各實驗組大鼠心肌組織TGF-β1 mRNA表達情況 與 RSD組比較，MI7d+Sham組 TGF-β1 mRNA的相對表達量明顯升高（2.00±0.09比0.99±0.12，P＜0．01)；與 MI7d+Sham 組比較，MI7d+RSD 組TGF-β1 mRNA相對表達量減少（1.47±0.09比2.00±0.09，P＜0．01）。見圖 3。

2.5 Western-blot法檢測大鼠心肌組織TGF-β1的表達水平 與RSD組比較，MI7d+Sham組TGF-β1表達水平明顯升高（0.73±0.02 比 0.29±0.02，P＜0．01）；與 MI7d+Sham 組比較，MI7d+RSD 組 TGF-β1蛋白表達水平顯著下降（0.46±0.04比 0.73±0.02，P＜0．01）。見圖 4。

3 討論

心肌梗死后，以交感神經(jīng)系統(tǒng)及RASS系統(tǒng)的激活為病理生理特征，通過增加左心室負荷影響心功能。心衰早期心臟排出量不足時，機體會啟動神經(jīng)內(nèi)分泌機制代償，以維持心排出量及重要臟器的灌注壓[11]。然而，長期交感神經(jīng)興奮必然會增加腎素水平、增加腎血管阻力引起左心室肥厚和心肌纖維化等一系列負面變化，出現(xiàn)心功能不全及惡性心律失常[12]。腎臟交感神經(jīng)激活與心肌梗死所致的心力衰竭時的水鈉潴留相關(guān)，且能促進心梗后心衰的發(fā)展，阻斷交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活對心力衰竭的治療是一個有價值的方法[13]。抑制交感神經(jīng)系統(tǒng)和RASS系統(tǒng)的過度激活是近年來治療的重要方向。研究顯示，RSD明顯增加心衰患者的6 min步行距離[7]。Clayton等[14]的研究表明，RSD可有效降低兔心衰模型血漿BNP水平。

本實驗分別通過結(jié)扎冠脈前降支和腎血管化學消融法構(gòu)建心肌梗死和腎去交感神經(jīng)動物模型，采用心臟超聲、RT-PCR及western-blot等方法，研究RSD對心肌梗死大鼠心功能及心肌纖維化的影響，探討其在心肌梗死大鼠心肌纖維化中的作用，以期為心肌梗死后心功能的改善及延緩/逆轉(zhuǎn)心肌纖維化和改善心室重構(gòu)尋找新的治療靶點。

目前構(gòu)建RSD模型的方法主要有化學消融法及經(jīng)導(dǎo)管介入射頻消融法。研究顯示，這兩種方法均能明顯降低腎去甲腎上腺素溢出，并可降低腎交感神經(jīng)活性。本實驗采用手術(shù)剝離腎動脈和靜脈外膜交感神經(jīng)，再涂抹苯酚，直接損傷神經(jīng)纖維達到去腎交感支配的目的，構(gòu)建RSD模型。術(shù)后采用電刺激神經(jīng)的方法來驗證去腎交感神經(jīng)是否成功。腎神經(jīng)影響腎血流動力學，去腎交感前，直接電刺激腎神經(jīng)干近端10～30 s會引起腎血管收縮，同時引起心率和血壓的波動［心率加快8～15次/min，收縮壓上升 5～10 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）］，腎臟變蒼白，而去腎交感支配后，上述一系列反應(yīng)消失，提示去腎交感神經(jīng)造模成功。本實驗中，RSD是在建立心梗模型后7 d進行，此時心梗大鼠交感興奮開始逐漸減弱，從大鼠存活率方面考慮，心梗造模即刻及術(shù)后第1周內(nèi)，其對麻醉及手術(shù)操作的耐受均較差，且麻醉和手術(shù)本身可能影響心功能，故綜合以上兩個因素，選擇心梗后第7 d作為RSD手術(shù)時間點。

本實驗采用結(jié)扎前降支的方法構(gòu)建大鼠心肌梗死模型，心梗后心肌細胞出現(xiàn)壞死、纖維化，導(dǎo)致心肌病理性重構(gòu)，為研究心梗后病理生理變化通用的動物模型。本研究建立大鼠心肌梗死模型后行超聲多普勒檢查和心肌組織Masson染色，可見心肌梗死組（MI7d+Sham組）較正常對照組和去交感組（Control組和RSD組）心功能明顯下降且出現(xiàn)心肌纖維化，提示心肌梗死造模成功（圖1，圖2）。本實驗心肌梗死RSD治療組（MI7d+RSD組）較心肌梗死組（MI7d+Sham組）心功能指標LVESD降低，LVFS和LVEF值增高，表明RSD可改善心肌梗死大鼠心功能（圖1）。心肌梗死后發(fā)生心肌重塑，而心肌纖維化是其重要發(fā)生機制，心肌纖維化不但加重心肌梗死后心肌缺血缺氧，增加室壁僵硬度，且降低室壁順應(yīng)性，影響舒張期心室充盈，并會影響心肌細胞之間力的產(chǎn)生和傳遞，使部分心室肌組織喪失收縮功能，加重心功能損害。從本實驗Masson染色結(jié)果看，相比RSD組，心肌梗死模型組（MI7d+Sham組）心肌間質(zhì)膠原纖維顯著增加，而腎去交感干預(yù)組（MI7d+RSD組）的CVF較MI7d+Sham組降低（圖2），表明RSD可抑制心肌梗死大鼠心肌纖維化，為改善心功能提供理論依據(jù)。

心肌纖維化時，除表現(xiàn)為膠原含量增加外，TGF-β1等細胞因子的濃度也會發(fā)生變化，并參與纖維化的發(fā)生、發(fā)展。研究證實，TGF-β1是一種促纖維化蛋白因子，可促進缺血后細胞增殖及胞外基質(zhì)重構(gòu)，誘導(dǎo)心肌纖維化，導(dǎo)致心功能不全。成纖維細胞基質(zhì)金屬蛋白酶（fibroblast matrix metalloproteinases，MMPs）可促進心臟成纖維細胞增殖和遷移，促進膠原沉積和抑制間質(zhì)膠原酶誘導(dǎo)心室纖維化，而金屬基質(zhì)蛋白酶組織抑制因子1（Tissue inhibitors of metalloproteinase 1，TIMP1）可調(diào)節(jié) MMPs水平和活性。Stawowy等[15]證實，TGF-β1可上調(diào)MMPs水平并提高活性，影響MMPs/TIMP1的平衡，導(dǎo)致心梗后心肌纖維化，最終引起心室變薄、心功能失代償。心肌梗死后交感神經(jīng)激活，不僅通過增加去甲腎上腺素釋放促進成纖維細胞合成TGF-β1，而且通過刺激RAAS促進TGF-β1的合成[16]。TGF-β1可直接作用于心肌細胞、成纖維細胞，引起心肌肥厚及胞外基質(zhì)沉積，加快心肌纖維化進程[17]。

從本實驗RT-PCR結(jié)果看，與MI組相比，MI7d+RSD組心肌組織TGF-β1 mRNA的相對表達量明顯降低（圖3）。從western-blot結(jié)果看，正常對照組（Control組）和RSD組大鼠心肌組織中TGF-β1蛋白未見明顯陽性表達，而MI組表達量明顯增加，MI7d+RSD組能明顯減少這種增加趨勢（圖4），推測TGF-β1參與大鼠心肌梗死后心肌纖維化過程，很好解釋了本研究Masson染色結(jié)果，并且與既往相關(guān)報道相符。

綜上所述，本研究探討了RSD對心梗大鼠心功能、心肌纖維化的影響及其可能的發(fā)生機制。腎去交感支配可以改善心肌梗死后大鼠心功能，并延緩心梗后心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展，可能與抑制TGF-β1的表達有關(guān)。由于存在腎交感神經(jīng)再生可能，尚需觀察長期實驗效果或必要時再次RSD處理。另外，RSD對局部和全身交感系統(tǒng)以及RAAS系統(tǒng)的影響及相關(guān)具體機制尚有待深入研究。

（本文圖片第863、864頁）

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Effect of renal sympathetic denervation on myocardial fibrosis and the expression of TGF-β1 in rats with myocardial infarction

ZHENG Xiao-xin，HOU Guo，QIU Xuan，et al.Department of Cardiology，Renmin Hospital of Wuhan University，Hubei Key Laboratory of Cardiology，Cardiovascular Research Institute，Wuhan 430060，China

Objective To observe the effect of renal sympathetic denervation（RSD）on myocardial fibrosis and the expression of transforming growth factor-β1（TGF-β1）in myocardial infarction（MI）rats．Methods 52 SPF level SD rats were randomly divided into four groups，control group，RSD group，MI7d+Sham group and MI7d+RSD group．Bilateral renal sympathectomy or sham operation were performed in RSD group and MI7d+RSD group or MI7d+Sham group，separately.Ultrasound was adopted to evaluate the changes of left ventricular endsystolic diameter（LVESD），left ventricular fractional shortening（LVFS） and left ventricular ejection fraction（LVEF）．Masson staining was used to measure the collagen volume fraction（CVF）．RT-PCR and western-blot methods for the detection of myocardial mRNA and protein expression levels of TGF-β1，respectively．Results LVESD was lower in MI7d+RSD group than those in MI7d+Sham group，and LVFS and LVEF were higher［LVESD（3.13±0.25）mm vs （5.23±0.15）mm，P＜0．01，LVFS（38.2±4.5）%vs （23.1±3.3）%，P＜0．01，LVEF（61.7±1.3）%vs （40.4±2.7）%，P＜0．01］．Compared with MI7d+Sham group，CVF was lower in MI7d+RSD group［（42.66±7.55）%vs （59.33±9.79）%，P＜0．01］，and the relative expression of TGF-β1 mRNA was lower than that in MI7d+Sham group（1.47±0.09 vs 2.00±0.09，P＜0．01），and the relative expression of TGF-β1 protein was lower than that in MI group（0.46±0.04 vs 0.73±0.02，P＜0．01）．Conclusion Renal sympathetic denervation can inhibit myocardial fibrosis in rats post-MI and improve heart function，which may be achieved by inhibiting theexpression of myocardial TGF-β1.

Renal sympathetic denervation； Myocardial infarction； Myocardial fibrosis； Transfer growth factor-β1

JIANG Xue-jun，E-mail：xjjiang@whu.edu.cn

中央高校專項科研項目基金（項目編號：2042015kf0074）

430060 湖北省武漢市，武漢大學人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，心血管病湖北省重點實驗室，武漢大學心血管病研究所

蔣學俊，E-mail：xjjiang@whu.edu.cn

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．09．021

Q95-33；R542.2+2

A

1672-5301（2016）09-0845-05

2016-04-13）