用于未純化蛋白樣品核酸適配體篩選的Western 印跡-SELEX篩選技術(shù)的建立

李慧 ，趙強(qiáng)，梁超，丁紅梅，李潔，黃皚雪，蘇雪婷，張令強(qiáng)，李少華，邵寧生

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院a.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所；b.放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所；北京 100850

指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術(shù)是一種新型的高通量生物文庫(kù)篩選技術(shù)[1-2]。經(jīng)SELEX技術(shù)獲得基于空間結(jié)構(gòu)，與靶分子高特異性、高親和力結(jié)合的寡核苷酸配基被稱為適配體（aptamer）。由于隨機(jī)文庫(kù)中的寡核苷酸序列能形成多樣的空間結(jié)構(gòu)，因此SELEX 技術(shù)可篩選的靶分子范圍十分廣泛，包括金屬離子、蛋白多肽、有機(jī)染料等，其中蛋白多肽類靶分子最多，包括酶、生長(zhǎng)因子、抗體、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞黏附分子和選擇素等[3-7]。完整的病毒顆粒、細(xì)菌病原體，甚至完整的哺乳動(dòng)物細(xì)胞也可以通過完整細(xì)胞消減SELEX 技術(shù)篩選出其高親和力的寡核苷酸配基[8-11]。SELEX 技術(shù)作為一種極其有用的分子生物學(xué)工具日益受到重視，并在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床診斷和疾病治療中都顯示了廣闊的應(yīng)用前景。

傳統(tǒng)SELEX 技術(shù)中以蛋白多肽類物質(zhì)為靶標(biāo)進(jìn)行篩選時(shí)，首先需要獲得單一的純化蛋白，而很多蛋白、多肽類物質(zhì)并不是單一的純蛋白，從而使其無(wú)法作為靶標(biāo)進(jìn)行篩選。因此，我們嘗試將Western印跡和SELEX 技術(shù)交叉結(jié)合，建立基于免疫印跡的蛋白篩選技術(shù)，即Western 印跡-SELEX 技術(shù)。利用該方法對(duì)蛋白、多肽類靶物質(zhì)進(jìn)行篩選時(shí)，不要求靶蛋白是純化的、單一的，大大降低了篩選靶標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)，提高了篩選效率。

1 材料與方法

1.1 隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)和引物

文庫(kù)兩端為固定的引物退火序列，中間為含45個(gè)堿基的隨機(jī)序列，Gp45 文庫(kù)序列為5'-GCAATG GTACGGTACTTCC（45N）CAAAAGTGCACGCTACT TTGCTAA-3'。正向引物Plong-1［5'-GCAATGGTA CGGTACTTCC-3'，5'端進(jìn)行生物素（Bio）修飾］，反向引物Pstem-loop（5'-GCTAAGCGGGTGGGACTTCC TAGTCCCACCCGCTTAGCAAAGTAGCGTGCACTTT TG-3'），反向引物Pll（5'-TTAGCAAAGTAGCGTGC ACTTTTG-3'）。Pll 用于擴(kuò)增雙鏈產(chǎn)物；Pstem-loop除含有與模板互補(bǔ)的序列外，5'端還含有33 個(gè)富含GC堿基的反向重復(fù)序列（下劃線部分），用于阻斷正鏈的延伸，PCR產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的單鏈DNA（ssDNA）。

1.2 Western印跡-SELEX篩選流程

取約1200 pmol 的Bio-Gp45 文庫(kù)，100℃加熱5 min 后迅速置于冰上冷卻10 min，加入結(jié)合緩沖液（1×PBS，1 mmol/L MgCl2，1 μg/μL ytRNA，1 μg/μL wDNA，0.1% BSA）中，孵育體系為100 μL。文庫(kù)先與轉(zhuǎn)有消減蛋白的PVDF 膜于37℃孵育60 min，回收未結(jié)合的ssDNA，即消減文庫(kù)，再與轉(zhuǎn)有靶蛋白的PVDF膜于37℃孵育60 min，將PVDF膜放入含5 mL 洗滌緩沖液（1×PBS，1 mmol/L MgCl2）的平皿中洗滌3 次，每次5 min，再將PVDF 膜剪碎放入EP 管中，加入200 μL ddH2O，95℃煮10 min，離心收集液體，取5 μL做模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。重復(fù)上述步驟，共進(jìn)行4 輪篩選。隨著篩選輪次的增加，逐漸增加洗滌次數(shù)，縮短文庫(kù)與靶蛋白孵育的時(shí)間，增加SELEX篩選的特異性。

1.3 次級(jí)文庫(kù)的生成和回收

采用不對(duì)稱引物PCR 方法獲得次級(jí)ssDNA 文庫(kù)，以Bio-Plong-1 和Pstem-loop 為引物，按100 μL體系進(jìn)行PCR 反應(yīng)（95℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，37℃退火80 s，58℃延伸1 min；最后58℃終延伸5 min）。為減少非特異性擴(kuò)增，提高文庫(kù)質(zhì)量，須優(yōu)化PCR 擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)，9 個(gè)循環(huán)開始，每隔3 個(gè)循環(huán)取一次樣，共擴(kuò)增30 個(gè)循環(huán)，上樣7 mol/L 尿素8%變性PAGE 膠分析，選擇目的條帶清晰的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)進(jìn)行大量PCR 擴(kuò)增，經(jīng)7 mol/L 尿素8%變性凝膠分離，切膠回收目的單鏈，經(jīng)洗脫、乙醇沉淀和離心，最終獲得Bio標(biāo)記的次級(jí)篩選文庫(kù)。

1.4 富集文庫(kù)的克隆、測(cè)序與分析

將富集文庫(kù)用對(duì)稱PCR 方法擴(kuò)增成雙鏈DNA（dsDNA），切膠純化后連接到pUC18T 載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，隨機(jī)挑選50 個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定，采用RNAstructure 4.6軟件和MEME在線軟件（httt://meme.sdsc.edu/meme/cgi-bin/meme.cgi）分析適配體的一、二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.5 適配體的特異性檢測(cè)

將一定濃度的Bio 標(biāo)記的適配體溶解于合適體積的緩沖液（1×PBS，1 mmol/L MgCl2）中，100℃變性5 min 后立即置于冰上充分冷卻10 min，與轉(zhuǎn)有靶蛋白（或其他無(wú)關(guān)蛋白，作為陰性對(duì)照）的PVDF 膜于37℃共孵育60 min，用洗滌緩沖液（1×PBS，1 mmol/L MgCl2）洗膜3 次，每次3 min，再將膜放到按1∶300 稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）反應(yīng)液中室溫孵育40 min，用同上洗滌緩沖液洗膜3 次，每次3 min，室溫避光加顯色液顯色3 min，暗室壓片顯影。

在96 孔ELISA 板中每孔加入含2 μg 靶蛋白的蛋白包被液100 μL，4℃包被過夜，次日棄包被液，每孔加入100 μL 含1%酪蛋白（casein）的馬來酸封閉液，室溫封閉60 min，將不同濃度Bio 標(biāo)記的適配體溶解于100 μL 孵育緩沖液（1×PBS，1 mmol/L MgCl2）中，100℃變性5 min 后立即置于冰上充分冷卻10 min，再加到包被有靶蛋白的酶聯(lián)條中，37℃孵育3 h，棄去孔內(nèi)液體，每孔用350 μL 洗滌液洗滌3次，最后一次洗滌后把孔內(nèi)液體完全甩干，每孔加入100 μL 按1∶100 稀釋的HRP，室溫孵育40 min，棄去孔內(nèi)液體，洗板5 次，每孔加入100 μL TMB 顯色底物37℃避光顯色，當(dāng)有明顯顏色變化時(shí)，加10 μL終止液，酶聯(lián)儀讀取D450nm值。

2 結(jié)果

2.1 Western印跡-SELEX技術(shù)的建立

利用Western 印跡將相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過電泳區(qū)分開，并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，通過BiossDNA 文庫(kù)先與消減靶標(biāo)孵育后，回收未結(jié)合的Bio-ssDNA 文庫(kù)，將其與篩選靶標(biāo)共同孵育，進(jìn)一步通過洗滌、PCR 擴(kuò)增、切膠回收獲得次級(jí)文庫(kù)，其流程如圖1。

2.2 特異識(shí)別靶蛋白的ssDNA適配體的富集

采用Western 印跡-SELEX 技術(shù)進(jìn)行循環(huán)篩選，利用生物素-鏈霉親和素-辣根過氧化物酶系統(tǒng)檢測(cè)每輪次級(jí)文庫(kù)的富集情況。顯影結(jié)果顯示，隨著篩選輪次的增加，與靶蛋白特異結(jié)合的適配體逐漸得到富集，與前3 輪富集文庫(kù)相比，第4 輪文庫(kù)中適配體的富集量得到大幅提升，暗室壓片結(jié)果可見明顯條帶（圖2），提示經(jīng)過4輪篩選得到的寡核苷酸配基特異識(shí)別靶蛋白。

2.3 適配體一級(jí)結(jié)構(gòu)同源性及二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

將第4 輪富集文庫(kù)進(jìn)行克隆測(cè)序，得到50 個(gè)適配體的序列，經(jīng)MEME 在線軟件對(duì)序列的同源性進(jìn)行比較，共分為6 個(gè)家族（圖3）；進(jìn)一步利用RNA structure 軟件對(duì)每個(gè)家族中所包含序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，初步挑選出6條適配體。

2.4 適配體與靶蛋白結(jié)合的特異性分析

Western 印跡分析表明，同原始文庫(kù)Gp45 相比，挑選出的6 條適配體均與靶蛋白有一定的結(jié)合，其中6#適配體與靶蛋白的結(jié)合最強(qiáng)，只特異結(jié)合靶蛋白而不結(jié)合無(wú)關(guān)對(duì)照蛋白，而原始文庫(kù)Gp45則與上述蛋白均無(wú)結(jié)合（圖4）。

ELISA 分析表明，經(jīng)生物素-鏈霉親和素-辣根過氧化物酶系統(tǒng)檢測(cè)后，6#適配體與靶蛋白孵育后的D450nm值最大，遠(yuǎn)高于原庫(kù)Gp45，這一結(jié)果與Western 印跡檢測(cè)結(jié)果一致。提示6#適配體不僅能特異識(shí)別經(jīng)SDS 變性處理的靶蛋白，還能特異識(shí)別天然結(jié)構(gòu)的靶蛋白（圖4）。

圖1 Western印跡-SELEX篩選技術(shù)路線

圖2 富集文庫(kù)與靶蛋白結(jié)合的鑒定

3 討論

SELEX技術(shù)作為一種極其有用的分子生物學(xué)工具而日益受到重視，并在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床診斷和疾病治療中顯示了廣闊的應(yīng)用前景。SELEX技術(shù)具有很多優(yōu)點(diǎn)：①經(jīng)SELEX 技術(shù)篩選出的寡核苷酸配基具有很強(qiáng)的特異性。茶堿與其他黃嘌呤類似物如咖啡因、可可堿的結(jié)構(gòu)非常相似，而通過SELEX 方法篩選到的寡核苷酸配基只特異性地結(jié)合茶堿，與其他類似物無(wú)反應(yīng)，與茶堿的親和力比與咖啡因的親和力高10 000倍[12]。由于寡核苷酸配基與蛋白質(zhì)的結(jié)合力高于抗原與抗體之間的結(jié)合，因此，將生物素、熒光素、活性基團(tuán)偶聯(lián)到寡核苷酸配基上，可對(duì)新蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞定位，也可用于分離純化蛋白質(zhì)。②由于寡核苷酸配基的高特異性和高親和力，將其作為診斷試劑比抗體具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確性，而且這種特異性和親和力還不受組織或樣品中非靶蛋白的干擾。單獨(dú)或與抗體組合應(yīng)用于多種診斷模式已顯示出其獨(dú)特的優(yōu)越性，特別是可以彌補(bǔ)抗體在診斷領(lǐng)域中應(yīng)用的不足。③SELEX技術(shù)篩選還具有周期短的優(yōu)點(diǎn)，并有望實(shí)現(xiàn)高通量篩選[13]。經(jīng)SELEX技術(shù)篩選出的適配體不受免疫條件和免疫原性限制，可體外人工合成，變性與復(fù)性可逆，可修飾，并有利于長(zhǎng)期保存和室溫運(yùn)輸。經(jīng)過近20 年的數(shù)據(jù)累積不難發(fā)現(xiàn)，人們?cè)诠押塑账崤浠涂贵w方面所做的努力是朝著一個(gè)相同的方向邁進(jìn)的。鑒于SELEX技術(shù)的優(yōu)越性，也許在不久的將來，寡核苷酸配基很可能成為被動(dòng)免疫中抗體的替代物，實(shí)驗(yàn)室里的單克隆抗體制備技術(shù)將會(huì)被一種費(fèi)用不高、較為方便的SELEX技術(shù)所替代。

圖3 MEME在線軟件分析序列的同源性

圖4 挑選出的6條適配體與靶蛋白特異結(jié)合的鑒定

文庫(kù)是否富集是SELEX 篩選成敗的重要指標(biāo)。經(jīng)過4 輪篩選，我們獲得了能夠與靶蛋白特異結(jié)合的富集文庫(kù)，分析、純化這些差異適配體并對(duì)其進(jìn)行DNA 序列測(cè)定，根據(jù)序列同源性及二級(jí)結(jié)構(gòu)得到6 條有代表性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的適配體，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)2#、3#、5#和6#適配體均能與靶蛋白特異結(jié)合，其中6#適配體與靶蛋白的結(jié)合最明顯，只特異結(jié)合靶蛋白而不結(jié)合無(wú)關(guān)對(duì)照蛋白。這一結(jié)果一方面說明我們建立的Western 印跡-SELEX 技術(shù)是可信穩(wěn)定的，另一方面也表明適配體可以像抗體一樣作為診斷試劑，或經(jīng)過改造用于預(yù)防與治療疾病。

綜上，我們建立了一種新的SELEX 篩選方法，即Western 印跡-SELEX。蛋白質(zhì)的Western 印跡技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫測(cè)定的特異敏感等多種特點(diǎn)，可檢測(cè)到低至1～5 ng 的靶蛋白。將Western 印跡和SELEX 技術(shù)結(jié)合起來，可以實(shí)現(xiàn)非純化蛋白的篩選，大大提高了篩選速度和效率，為SELEX 技術(shù)在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床診斷和疾病治療等方面開辟了一條新的途徑，有良好的應(yīng)用前景。

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