北蟲草小分子肽抗氧化和耐缺氧機制研究

仵強 ，黃竹青，劉芹，王立強，周青陽，王洪軍，吳揚，孫艷

1.陜西楊凌天和生物科技有限公司，陜西 楊凌 712100；2.遼寧衛(wèi)生技術(shù)職業(yè)學院，遼寧 沈陽 110101；3.沈陽軍區(qū)聯(lián)勤部 疾病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽 110034；4.吉林大學 第一臨床醫(yī)院，吉林 長春 130021；5.沈陽藥科大學，遼寧 沈陽 110016

北蟲草小分子肽是由北蟲草子實體蛋白質(zhì)經(jīng)酶水解后生成，具有抑制生物大分子過氧化或清除體內(nèi)自由基的功能，相對分子質(zhì)量低于10 000 的小分子肽類。本課題組前期工作表明，北蟲草含有17 種氨基酸[1]，其中多種氨基酸如半胱氨酸、組氨酸、色氨酸、賴氨酸、精氨酸、亮氨酸和纈氨酸、5-羥色氨酸及其衍生物具有抗氧化能力。氧化反應(yīng)在人體代謝過程中產(chǎn)生自由基和活性氧基團，這些基團過多會對機體產(chǎn)生致死性損傷，特別是自由基可與活細胞中的糖、氨基酸、磷脂、核酸等發(fā)生反應(yīng)而造成機體中毒。為進一步研究北蟲草小分子肽抗氧化活性機制，開發(fā)北蟲草小分子肽的實用價值，我們利用化學模型和動物模型探討了北蟲草小分子肽的抗氧化和心肌耐缺氧機制。

1 材料與方法

1.1 材料

Sprague-Dawley（SD）大鼠，雌雄各半，體重（200±25）g，購自沈陽藥科大學實驗動物部（動物合格證號：遼實動字號第033 號），在實驗室分籠飼養(yǎng)，實驗室溫度（16±2）℃，顆粒飼料，自動進食飲水，適應(yīng)1 周后進行實驗。北蟲草小分子肽（5.78 mg/mL）以人工培養(yǎng)北蟲草子實體為原料，經(jīng)粉碎、蛋白提取、加熱酶解、滅酶、抽濾、超濾和滅菌制備獲得，為相對分子質(zhì)量低于10 000 的混合物。木瓜蛋白酶購于廣州裕立寶生物科技公司；堿性蛋白酶購于Novozymes 公司；PTN6.0 購于杭州三葉生物化工廠；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）、谷胱甘肽（GSH，色譜純）和Ferrozine鐵試劑（分析純）購自Sigma 公司；鄰二氮菲、二苯代苦味肼、鄰苯三酚、氫氧化鈉、雙氧水、硫酸亞鐵、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）等試劑均為分析純，購自國內(nèi)試劑公司。WFZ UV-2000 型紫外可見分光光度計（上海尤尼柯公司）；KND-2C型定氮儀（上海纖檢儀器有限公司）；PHS-25 數(shù)顯pH 計（上海精密科學儀器有限公司）；101A-2 型數(shù)顯電熱鼓風干燥箱（上海浦東躍欣科學儀器廠）；GL-21M 高速冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）。

1.2 小分子肽清除羥基自由基（·OH-）能力測定[2]

采用鄰二氮菲法，以去離子水配制濃度分別1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL 的小分子肽溶液與還原型GSH對照液。

樣品管：取1.5 mL 鄰二氮菲溶液（5 mmol/L）加入2 mL磷酸鹽緩沖液（pH7.4）混勻，加入2 mL樣品溶液及0.5 mL EDTA（15 mmol/L），混勻，加入1 mL FeSO4溶液（5 mmol/L），用去離子水補至9 mL，充分混勻后加入1 mL H2O2（0.1%），搖勻，置37℃保溫1 h，以D536nm值變化反映羥基自由基的氧化作用。損傷管：以去離子水代替樣品，其余步驟同樣品管。未損傷管：以去離子水代替H2O2，同損傷管。以還原型GSH為對照，計算·OH-清除率。

1.3 小分子肽清除二苯代苦味肼基自由基（DPPH-·）測定[3]

取0.00 395 g DPPH，用95%乙醇溶解定容至100 mL，配置成0.1 mmol/L 的DPPH 溶液。小分子肽溶液與還原型GSH 對照液同1.2。取各樣品液和對照液2.0 mL 與2.0 mL DPPH 溶液混勻，置室溫30 min，測定D517nm值，以95%乙醇為空白對照，取3次測定的平均值，計算DPPH-·清除率。

1.4 小分子肽清除超氧陰離子自由基（）測定[4]

將鄰苯三酚溶于10 mmol/L HCl，配置成3 mmol/L 的溶液，小分子肽溶液與還原型GSH 對照液同1.2。取100 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH8.2）4.5 mL，25℃水浴20 min 后立即加樣品2 mL、蒸餾水3 mL、鄰苯三酚0.5 mL（25℃保溫），迅速混勻，恒溫下每隔30 s測一次D325nm值，反應(yīng)4.5 min 結(jié)束，樣品抑制鄰苯三酚自氧化速率為V樣；空白管以10 mmol/L HCl 代替鄰苯三酚溶液，反應(yīng)啟動后4.5 min 內(nèi)鄰苯三酚自氧化速率為V自，按下式計算清除率：

1.5 小分子肽提高心肌耐缺氧能力測定

[5]并有改動。大鼠48只隨機分為4組，即對照組、實驗組（包括3、10、30 mg/kg 組）。實驗組按1.0 mL/20 g體重每天灌胃，對照組給予同體積的蒸餾水，持續(xù)4周，末次給藥后1 h麻醉動物，切開頸部皮膚，分離氣管，四肢連接心電監(jiān)護儀，觀察心肌活動情況，然后用動脈夾夾住氣管，并按動秒表計時，直至心臟停止跳動，記錄心肌耐缺氧時間。

1.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學處理

采用SPSS 10.0 統(tǒng)計分析軟件，結(jié)果以表示，組間的兩兩比較采用單因素方差分析，組間P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 小分子肽清除·OH-的能力

結(jié)果見圖1，小分子肽和GSH 濃度為1～3 mg/mL 時，二者清除·OH-的能力隨濃度增加而升高，小分子肽組明顯高于GSH 對照組［（87.6±1.72）%和（70.4±0.94）%，P＜0.05］；當濃度為4～5 mg/mL 時，對·OH-的清除能力趨于平緩，兩者無顯著性差異［（89.7±1.63）%和（88.9±1.41）%，P＞0.05］。

圖1 小分子肽清除·OH-能力測定

2.2 小分子肽清除DPPH-·的能力

結(jié)果見圖2，隨小分子肽和GSH 濃度的增加，兩者清除DPPH-·的能力也提高，小分子肽組明顯高于GSH 對照組［（77.7±0.17）%和（55.7±0.29）%，P＜0.05］；當濃度為3 mg/mL 時，兩者對DPPH-·的清除率達80%以上，但濃度繼續(xù)增加時其清除力趨于平臺期，對DPPH-·的清除能力基本接近［（90.1±0.14）%和（86.9±1.06）%，P＞0.05］。

2.4 心肌耐缺氧能力測定

結(jié)果見表1，北蟲草小分子肽對小鼠有抗心肌缺氧的作用，與對照組比較差異顯著（P＜0.01），呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，隨著劑量的增加，作用加強。

圖2 小分子肽清除DPPH-·能力測定

圖3 小分子肽清除·能力測定

表1 北蟲草小分子肽對小鼠心肌耐缺氧的影響（n=12，）

表1 北蟲草小分子肽對小鼠心肌耐缺氧的影響（n=12，）

*與對照組比較，P＜0.01

3 討論

1956年英國學者Harman就提出了自由基學說，認為自由基具有高度的化學反應(yīng)活性，是人體生命活動中多種生化反應(yīng)的中間代謝產(chǎn)物，能夠攻擊生物大分子，造成組織細胞損傷，是引起機體衰老的根本原因，也是誘發(fā)腫瘤等惡性疾病的重要起因。正常情況下，人體內(nèi)自由基處于不斷產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡中，但自由基產(chǎn)生過多或清除過慢時，它通過攻擊生物大分子物質(zhì)及各種細胞器，會造成機體在分子水平、細胞水平及組織器官水平的各種損傷，加速機體的衰老進程并誘發(fā)各種疾病[6-7]。本實驗結(jié)果表明，北蟲草小分子肽對·OH-和DPPH-·的清除能力在一定的劑量范圍內(nèi)與濃度呈正相關(guān)，達到一定劑量時出現(xiàn)平臺期，并與GSH的清除能力相同。在·的清除能力方面，小分子肽弱于GSH。在此基礎(chǔ)上的動物體內(nèi)試驗結(jié)果表明，北蟲草小分子肽對大鼠具有耐心肌缺氧的作用，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。分析探討其機理，氨基酸種類、序列和構(gòu)型可能是決定其抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。我們用高效液相色譜測定，北蟲草含有豐富的亮氨酸、酪氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和脯氨酸等[8]，其中谷氨酸、天冬氨酸和脯氨酸含量接近亮氨酸、酪氨酸的2 倍。這些氨基酸殘基是組成抗氧化肽的必要成分，它們通過將氫原子提供給自由基，形成吲哚自由基和苯氧自由基，借助共振而穩(wěn)定，達到自由基鏈式反應(yīng)減慢或終止的目的[9]。芳香族氨基酸可通過供氫發(fā)揮抗氧化作用。如酪氨酸是典型的供氫體，苯環(huán)為共軛體系，使其酚羥基上電子氧電子云密度增大，其共軛體系受側(cè)鏈上的基團影響，尤其是酪氨酸對位的甲基，其誘導效應(yīng)進一步使酚羥基氧的密度增大，并且使其脫掉質(zhì)子后形成的自由基中間體更趨于穩(wěn)定，所以認為抗氧化肽的高生物活性在于肽鏈內(nèi)氨基酸間的短程相互作用，強化了酪氨酸等作為質(zhì)子供體的作用，增加了作為自由基中間體的穩(wěn)定性。據(jù)報道，有抗氧化作用的肽具有通過清除自由基，增加Ca2+-Mg2+-ATP 酶（Ca2+泵）和Ca+-K+-ATP 酶（Na+泵）活性的作用，間接實現(xiàn)心肌細胞耐缺氧，延緩心肌衰老[10]。

綜上，北蟲草小分子肽是食品、保健品和化妝品領(lǐng)域具有產(chǎn)業(yè)化價值的生物活性肽。

參考文獻

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