TBK1 通過增強(qiáng)雌激素受體α的轉(zhuǎn)錄活性參與乳腺癌發(fā)生的分子機(jī)制

郝欽芳，鄒德勇，張麗萍，張小麗，葛曉幸，楊曉莉

武警總醫(yī)院 檢驗科，北京 100039

IKK 相關(guān)激酶是最近發(fā)現(xiàn)的功能和IKK（inhibitor of NF-κB kinase）相近的激酶，包括TANK 結(jié)合激酶1（TANK-binding kinase 1，TBK1）和IKKi（又稱為IKKε），均為絲氨酸激酶[1]。TBK1包含729個氨基酸殘基，其N 端1～290 位有一個激酶結(jié)構(gòu)域，在激酶結(jié)構(gòu)域之后的299～383 位之間存在一個泛素樣結(jié)構(gòu)域（ubiquitin-like domain，ULD），此外在603～650位及679～712 位包含2 個螺旋-環(huán)-螺旋（helix-loophelix，HLH）結(jié)構(gòu)域。激酶結(jié)構(gòu)域是TBK1 發(fā)揮其絲氨酸磷酸化的重要結(jié)構(gòu)域，而ULD 則與其激酶活性、與底物結(jié)合相關(guān)[2]。TBK1 幾乎在所有組織中穩(wěn)定表達(dá)，Northern 印跡分析表明，TBK1 在胃、小腸、肺、皮膚、腦、心臟、腎臟、肝臟、脾臟、胸腺等器官中廣泛表達(dá)[3]。

雌激素受體（estrogen receptors，ER）包括ERα和ERβ，它們都屬于核受體超家族[4]。ER 能夠激活含有雌激素應(yīng)答元件（estrogen responsive element，ERE）基因的轉(zhuǎn)錄，從而引起細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[5]。ERα在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用。研究表明，ERα的磷酸化可以影響其轉(zhuǎn)錄激活活性[6]。ERα磷酸化可影響ERα與DNA 和配體的結(jié)合能力以及ERα的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響其轉(zhuǎn)錄激活功能活性。ERα的Tyr537的磷酸化可調(diào)節(jié)ERα的二聚體化和DNA 結(jié)合能力，Ser118磷酸化可調(diào)節(jié)ERα的轉(zhuǎn)錄激活功能。用定向性位點(diǎn)突變試驗檢測ERα磷酸化后的活性，發(fā)現(xiàn)Ser118突變?yōu)锳la 后ERα的活性降低約25%，但與Ser104、Ser106同時突變時ERα活性可降低50%[7]?？傊?這些研究表明ERα的磷酸化影響其轉(zhuǎn)錄激活活性。

因為TBK1 具有激酶活性，而ERα又受磷酸化調(diào)控，我們推測TBK1 可能參與調(diào)控ERα。在本研究中，我們在細(xì)胞體系中過表達(dá)TBK1，發(fā)現(xiàn)其可以增強(qiáng)ERα的轉(zhuǎn)錄活性，而這與TBK1 在先天免疫途徑中的功能無關(guān)，而且TBK1 可以通過磷酸化ERα Ser305位調(diào)控其下游相關(guān)基因的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK293T、MCF-7 細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；大腸桿菌DH5α感受態(tài)菌株購自北京天根生化科技有限公司；Flag-ERα及其突變體、HA-ERα以及ERE-Luc 由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所葉棋濃研究員惠贈；Flag-TBK1 和HA-TBK1 及其突變體由本室構(gòu)建；抗Tubulin、抗Flag 購自Sigma 公司；HRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗及羊抗兔二抗購自中杉金橋生物科技公司。

1.2 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的制備

將新鮮的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌液接種至5～8 mL 含有抗生素的LB 培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min 過夜培養(yǎng)16～18 h，用天根公司的普通小提質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒，用分光光度計測定質(zhì)粒的D260nm和D280nm值，計算質(zhì)粒濃度，并依據(jù)D260nm/D280nm比值判斷所提質(zhì)粒的純度。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、傳代和轉(zhuǎn)染

細(xì)胞均用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，在含5% CO2的恒溫孵育箱中培養(yǎng)，采用胰酶消化法傳代。傳代時先吸去培養(yǎng)基，加入PBS清洗細(xì)胞；加入1 mL 胰酶消化液，輕輕搖動培養(yǎng)皿，使胰酶消化液覆蓋細(xì)胞表面，室溫放置3～5 min（根據(jù)不同細(xì)胞）；之后加入3 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，吹打細(xì)胞并形成細(xì)胞懸液；將細(xì)胞加入15 mL 離心管中，1000 r/min 離心至管底，用新鮮DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并加入新的細(xì)胞培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。凍存細(xì)胞株時，先用胰蛋白酶消化細(xì)胞，同上將細(xì)胞離心至15 mL 離心管底部，用含10%二甲基亞砜（DMSO）、20%胎牛血清、70% DMEM 培養(yǎng)基的凍存液重懸細(xì)胞，之后將含有細(xì)胞的凍存液分裝至細(xì)胞凍存管中，做好標(biāo)記，先置于-70℃過夜，次日取出并投入液氮罐中保存。

利用轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。6 cm 培養(yǎng)皿中細(xì)胞生長至60%～80%匯合度時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1 h 更換2 mL 新鮮的DMEM 培養(yǎng)基，將1 μg 質(zhì)粒和2 μL 脂質(zhì)體分別用生理鹽水稀釋，混勻后靜置5 min，將含有脂質(zhì)體的稀釋液逐滴加至含有質(zhì)粒的稀釋液中，混合后室溫放置15～20 min，使質(zhì)粒與脂質(zhì)體形成復(fù)合物，之后加入細(xì)胞中，輕輕晃動培養(yǎng)皿使之混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h 后更換新鮮培養(yǎng)基，24～48 h后收集細(xì)胞。

1.4 螢光素酶報告基因檢測

用12孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后將待測細(xì)胞中的培養(yǎng)基吸去，每孔加入1 mL PBS 漂洗細(xì)胞，之后每孔加入100 μL 1×裂解緩沖液（Promega公司），將12孔板置于搖床中，室溫裂解10 min后12 000 r/min 離心1 min，將上清轉(zhuǎn)移至新管中；將40 μL 細(xì)胞裂解液加入新試管中，之后在管中加入50 μL 螢光素酶檢測試劑（LAR），混勻后用螢光光度檢測儀檢測發(fā)光值（如果所測得數(shù)值不在量程之內(nèi)，則須調(diào)節(jié)螢光光度計的靈敏度），然后加入50 μL 反應(yīng)終止液，并測定海腎螢光素酶的發(fā)光值作為內(nèi)參，兩者的比值即為螢光素酶的活性。

1.5 免疫印跡實驗

將收集的細(xì)胞在4℃預(yù)冷的離心機(jī)中2000 r/min 離心5 min，棄盡上清；用1 mL 預(yù)冷的1×PBS 洗滌細(xì)胞2 次，吸盡PBS；加入凝膠上樣緩沖液，100℃沸水浴5 min，離心后進(jìn)行SDS-PAGE，電壓為80～120 V，具體操作參照《分子克隆實驗指南》（第3版）。

將PVDF 膜在甲醇中浸泡30 s，之后與2 張2.5 mm厚的濾紙在半干轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡；將電泳結(jié)束后的SDS-PAGE 膠浸入半干轉(zhuǎn)移緩沖液中，自下而上按照濾紙-膠-膜-濾紙的順序放置在半干轉(zhuǎn)移儀（Bio-Rad 公司）的2 塊電極之間，盡量趕盡膠和PVDF 膜之間的氣泡；設(shè)置轉(zhuǎn)移電壓18 V，轉(zhuǎn)移時間1.5 h；轉(zhuǎn)移結(jié)束后將PVDF 膜放入含5%脫脂奶粉的1×TBST 緩沖液中封閉1 h，之后用含1×TBST 或含5%脫脂奶粉的1×TBST，或者直接用1×PBST 配制的抗體（一抗）室溫孵育PVDF膜1 h或過夜孵育，結(jié)束后用TBST 洗3次，每次5～10 min；一抗孵育結(jié)束后，按需加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗體（二抗），室溫孵育1 h，用同上方法洗膜；每種抗體孵育結(jié)束后回收抗體，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，用X線膠片曝光。

1.6 細(xì)胞總RNA的提取及RT-PCR

由于RNase極易造成污染，故首先應(yīng)當(dāng)用DEPC浸泡處理所有容器以去除RNase。各種槍頭和EP管均使用無RNase產(chǎn)品（Axygen公司）。

用10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿后提取總RNA。首先吸去培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞，加入1 mL TRIzol 試劑（Invitrogen 公司）處理細(xì)胞，將所有液體轉(zhuǎn)移至新的EP 管中，14 000 r/min 離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的EP 管中合并，加入0.2 mL 氯仿，劇烈振蕩15 s 后靜置3 min，在預(yù)冷的離心機(jī)中離心15 min，小心吸取上層水相至新的EP管中，在收集的液體中加入0.5 mL 異丙醇，-20℃低溫冰箱中放置10 min（可在冰箱中長期保存）使RNA析出，離心10 min，小心倒去上清，用DEPC 水配制的75%乙醇洗滌，14 000 r/min離心5 min后棄盡上清，在無RNase 的通風(fēng)櫥中干燥，但不能吹得太干，將白色沉淀物在100 μL DEPC 處理過的水中溶解，用分光光度計測量D260nm值，并計算RNA 含量，之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察5S、18S、28S 核糖體rRNA條帶，用于判斷提取的RNA的質(zhì)量。

之后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系包括總RNA 1 μg、oligo（dT）（50 μmol/L）1 μL、RNase 抑制劑1 μL、反轉(zhuǎn)錄緩沖液5 μL、dNTP（2 mmol/L）5 μL、反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）0.5 μL，加DEPC 水至25 μL。在PCR 儀中進(jìn)行RT-PCR 反應(yīng)，反應(yīng)程序設(shè)置為42℃1 h、95℃5 min。反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 可用于后續(xù)特異性PCR反應(yīng)。

PCR反應(yīng)體系包括cDNA模板5 μL，10×PCR 反應(yīng)緩沖液5 μL，10 mmol/L dNTP 混合物1 μL，上、下游引物各1 μL，普通高效Taq酶（TaKaRa 公司）1 μL，加入去離子水補(bǔ)至50 μL。在PCR 儀上設(shè)置反應(yīng)條件為：95℃5 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃1 kb/min，循環(huán)次數(shù)根據(jù)不同基因的豐度調(diào)整，一般為14～22個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。利用β-actin引物擴(kuò)增β-actin，作為內(nèi)參。qPCR引物見表1。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 TBK1可以增強(qiáng)ERα的轉(zhuǎn)錄活性

為了研究TBK1 是否能調(diào)控ERα的轉(zhuǎn)錄活性，我們在HEK293T 細(xì)胞中瞬時轉(zhuǎn)染HA-ERα/Flag-TBK1 和ERE-Luc 報告基因（ERα轉(zhuǎn)錄結(jié)合元件，此報告基因的激活表示ERα入核啟動轉(zhuǎn)錄）及pRL 質(zhì)粒，選用HA-Vector（vector）/Flag-Vector（Ctrl）作為對照，檢測TBK1 對ERα轉(zhuǎn)錄活性的影響。實驗結(jié)果表明，與陽性對照組Flag-Vector（Ctrl）和HA-ERα相比，共轉(zhuǎn)Flag-TBK1 和HA-ERα能夠更為顯著地增強(qiáng)ERE 的轉(zhuǎn)錄活性；而作為陰性對照，共轉(zhuǎn)HAVector（vector）和Flag-Vector（Ctrl）或共轉(zhuǎn)HA-Vector（vector）和Flag-TBK1 時則幾乎不能增強(qiáng)ERELuc報告基因的轉(zhuǎn)錄活性（圖1A）。為了檢測這種轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)作用是否具有特異性，是否與雌激素的刺激有關(guān)，我們又選擇了能表達(dá)內(nèi)源ERα的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，并在體系中加入雌激素（E2）刺激，瞬時轉(zhuǎn)染Flag-TBK1，選用Flag-Vector（vector）作為對照。實驗結(jié)果顯示，在MCF-7 細(xì)胞中無論是否加入E2，TBK1都可以增強(qiáng)ERα的轉(zhuǎn)錄活性，而加入E2后TBK1的激活作用顯著增強(qiáng)（圖1B），說明TBK1對于ERα轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)具有特異性，既是雌激素依賴的，又是雌激素非依賴的。

表1 引物及序列

2.2 TBK1 增強(qiáng)ERα轉(zhuǎn)錄活性的功能不依賴于其激活先天免疫途徑的功能

為了研究TBK1 增強(qiáng)ERα轉(zhuǎn)錄活性的功能是否與其激活先天免疫途徑的功能相關(guān)，我們首先將Flag-TBK1 或Flag-TBK1（L352A，I353A）突變體（此突變體為實驗室保存，依照文獻(xiàn)報道，會喪失激活先天免疫途徑的功能）分別與IFN-β-Luc、IRF3-Luc、NF-κB-Luc 報告基因及pRL 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，同時轉(zhuǎn)染Flag-Vector（vector）作為陰性對照，24 h后收集細(xì)胞檢測熒光素酶活性，并通過Western印跡檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，野生型TBK1能明顯激活I(lǐng)FN-β、IRF3 和NF-κB，而Flag-Vector（vector）陰性對照和Flag-TBK1（L352A，I353A）突變體幾乎不能激活I(lǐng)FN-β和NF-κB 信號傳導(dǎo)通路（圖2），說明TBK1 的這2 個位點(diǎn)突變后使其喪失了激活先天免疫途徑的功能。

圖1 TBK1增強(qiáng)ERα的轉(zhuǎn)錄活性

接著，我們在MCF-7 細(xì)胞中瞬時轉(zhuǎn)染Flag-TBK1/Flag-TBK1（L352A，I353A）和ERE-Luc 報告基因及pRL質(zhì)粒，檢測TBK1及其先天免疫途徑功能缺失突變體對ERα轉(zhuǎn)錄活性的影響，并用Western印跡檢測各蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，TBK1（L352A，I353A）與野生型TBK1 一樣，都可以明顯增強(qiáng)ERα的轉(zhuǎn)錄活性（圖3），說明TBK1 對ERα轉(zhuǎn)錄活性的激活不依賴于其激活先天免疫途徑的功能。加入TBK1 的抑制劑BX795 后，TBK1 對ERα的激活作用受到明顯抑制證明了TBK1 對ERα的轉(zhuǎn)錄激活作用。為了探討TBK1 的激酶活性對其激活ERα轉(zhuǎn)錄活性的功能是否有影響，我們轉(zhuǎn)入Flag-TBK1（K38A）質(zhì)粒（激酶活性缺失突變體），檢測其對ERα的轉(zhuǎn)錄活性是否具有激活作用，發(fā)現(xiàn)其對報告基因的激活作用降至野生組的1/2 水平（圖3），說明TBK1 的激酶活性對其激活ERα轉(zhuǎn)錄活性的功能具有重要作用。

圖2 TBK1（L352A，I353A）不能激活先天免疫途徑

2.3 TBK1通過磷酸化修飾ERα的S305位增強(qiáng)其下游基因的表達(dá)

為了進(jìn)一步證明TBK1 對ERα轉(zhuǎn)錄活性的激活作用，尋找可能的作用機(jī)制，我們將TBK1 與ERα/ERα（S305A）突變體（磷酸化位點(diǎn)突變）共轉(zhuǎn)HEK293T 細(xì)胞，用RT-PCR 實驗檢測ERα下游基因的表達(dá)。結(jié)果表明，在野生型ERα存在時，TBK1 能夠明顯增強(qiáng)ERα下游基因的表達(dá)；在ERα（S305A）突變體存在時，TBK1卻不能增強(qiáng)ERα下游基因的表達(dá)（圖4）。野生型ERα下游基因的表達(dá)比磷酸化位點(diǎn)突變的ERα（S305A）下游基因的表達(dá)水平高（野生型ERα組的cyclin D1表達(dá)水平是突變體組的近3倍，Bcl-xL的表達(dá)水平是突變體組的近2倍，C3的表達(dá)水平是突變體組的近5 倍，c-fos的表達(dá)水平是突變體組的3 倍多，c-Myc的表達(dá)水平是突變體組的4倍，pS2的表達(dá)水平是突變體組的3 倍多，catD的表達(dá)水平是突變體組的近4 倍），不但證明了TBK1 對ERα轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)作用，而且證明這種作用是依賴于TBK1對其S305位的磷酸化修飾實現(xiàn)的。

圖3 TBK1（L352A，I353A）能夠激活ERα的轉(zhuǎn)錄活性

圖4 TBK1通過磷酸化修飾ERα S305位增強(qiáng)其下游基因的表達(dá)

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，雌激素在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中有極其重要的作用。轉(zhuǎn)錄因子ERα通過與雌激素結(jié)合，調(diào)控含ERE 基因的表達(dá)，因此，ERα在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。本研究的主要發(fā)現(xiàn)包括：TBK1可以增強(qiáng)ERα的轉(zhuǎn)錄活性；將TBK1 進(jìn)行L352A、I353A 位點(diǎn)突變后，其喪失激活先天免疫途徑功能，但仍然能夠增強(qiáng)ERα的轉(zhuǎn)錄活性，說明此作用不依賴于其在先天免疫途徑中的功能；TBK1 可以通過磷酸化ERα的S305 位激活ERα，使其入核啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步闡明了乳腺癌發(fā)生的機(jī)制，對乳腺癌的治療和靶向藥物開發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義。

TBK1中有一個重要的泛素樣結(jié)構(gòu)域，研究發(fā)現(xiàn)ULD 對于TBK1 的磷酸化活性以及其和下游磷酸化底物的結(jié)合有著重要的作用[1]。當(dāng)TBK1 的ULD 被突變之后，TBK1 就失去了與下游激酶底物IRF3 及IκBα結(jié)合的能力，從而失去激活下游Ⅰ型干擾素分泌及NF-κB 信號通路的功能。我們將ULD 中重要的352 位Leu 和353 位Ile 都突變?yōu)锳la，發(fā)現(xiàn)突變體組相比野生型TBK1組幾乎不能激活I(lǐng)FNβ及NF-κB信號傳導(dǎo)通路，但依然能夠激活ERα的轉(zhuǎn)錄活性，這就表明TBK1 參與ERα信號通路并不依賴于其對NF-κB 通路及IFN-β通路的激活，這些研究初步闡明了先天性免疫信號通路和乳腺癌發(fā)生之間的關(guān)系。

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