TPP1基因慢病毒干擾載體的構(gòu)建及鑒定

張金丁，金蕊，楊丹丹，王亞楠，黃君健，蘇金為

1.福建農(nóng)林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850；3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866

端粒是真核生物細(xì)胞染色體末端的天然保護(hù)結(jié)構(gòu)，由DNA重復(fù)序列TTAGGG和結(jié)合在端粒DNA序列上的端粒蛋白復(fù)合體組成，對穩(wěn)定基因組起到至關(guān)重要的作用[1]。端粒蛋白復(fù)合體（在哺乳類動物中被稱為shelterin）由6 個獨(dú)立的蛋白組成，分別是TRF1（端粒重復(fù)結(jié)合因子1）、TRF2、RAP1（阻抑蛋白/激活蛋白1）、TIN2（TRF1 相互作用蛋白1）、TPP1（TINT1[2]/PIP1[3]/PTOP1[4]）和Pot1（端粒保護(hù)蛋白1）。其中TRF1和TRF2 結(jié)合在雙鏈DNA 的端粒重復(fù)序列上，而Pot1 結(jié)合在單鏈懸突上，這些端粒DNA 結(jié)合蛋白通過TPP1和TIN2 的相互作用連接起來，在染色體末端保護(hù)和端粒長度調(diào)控中至關(guān)重要[5]。

有關(guān)TPP1 的研究表明，在腫瘤細(xì)胞中，TPP1 與Pot1的相互作用具有將Pot1帶入細(xì)胞核并端粒定位的功能，并在端粒末端負(fù)責(zé)聚集端粒酶，維持端粒長度的穩(wěn)態(tài)。也有相關(guān)研究表明，TPP1和TIN2 是調(diào)控裝配該蛋白復(fù)合體的關(guān)鍵元件，TRF1和TRF2 亞復(fù)合體的連接也需要TPP1和TIN2 的作用[6]。TPP1有助于穩(wěn)定TRF1-TIN2-TRF2 之間的相互作用，并促進(jìn)6個蛋白復(fù)合體的形成。TPP1高表達(dá)可以加強(qiáng)TIN2-TRF2 的結(jié)合，敲低TPP1 后會降低內(nèi)源TRF1與TRF2復(fù)合體結(jié)合的能力，并且蛋白復(fù)合體的形成也會受到嚴(yán)重影響[5]。我們利用質(zhì)粒載體pll3.7構(gòu)建了抑制人TPP1基因的短發(fā)夾RNA（shRNA）干擾載體，用于抑制端粒結(jié)合蛋白TPP1 的表達(dá)，為后期進(jìn)一步研究TPP1的生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

細(xì)胞株293T、HT1080、HepG2，大腸桿菌DH5α，質(zhì)粒pll3.7（圖1），慢病毒包裝載體RRE、REV、VSVG由本實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒pCDH-Flag-Pot1、pCDHFlag-TPP1 為本課題組構(gòu)建；質(zhì)粒提取試劑盒購自Exygen公司；膠回收試劑盒購自北京天根生物公司；限制性內(nèi)切酶HpaⅠ、XhoⅠ、EcoRⅠ，T4DNA 連接酶均購自NEB 公司；Flag 抗體和GAPDH 抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗均購自Sigma 公司；Western 印跡顯色試劑盒購自Thermo 公司；核酸電泳系統(tǒng)、蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)、半干轉(zhuǎn)膜儀均購自Bio-Rad公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 靶向TPP1的shRNA設(shè)計

根據(jù)shRNA設(shè)計原則[5]，參考GenBank公布的人TPP1序列（NM_000391.3）,利用Invitrogen 公司在線設(shè)計軟件設(shè)計shRNA 序列（表1），進(jìn)行BLAST 同源性分析，保證序列的惟一性。為方便克隆，在其5′端和3′端分別引入HpaⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)（為方便后期酶切鑒定，設(shè)計序列時將酶切位點(diǎn)的最后一個堿基削掉），反義鏈的3′端接終止信號TTTTTT，以終止轉(zhuǎn)錄。序列由英駿公司合成。

1.3 TPP1干擾載體的構(gòu)建

將合成的寡核苷酸鏈退火形成雙鏈DNA（95℃5 min，72℃10 min，自然降至室溫），同時將shRNA載體pll3.7 用HpaⅠ/XhoⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后，把退火形成的產(chǎn)物DNA 雙鏈與酶切回收的線性化載體片段于20℃連接4 h，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將其涂布在含氨芐西林的LB 平板上，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，每個平板挑4 個菌落進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，提質(zhì)粒，用EcoRⅠ/HpaⅠ酶切鑒定，將已插入shRNA片段的載體送北京博邁德公司測序。

1.4 慢病毒的包裝與感染

將293T 細(xì)胞接到10 cm 皿中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時，將慢病毒包裝載體RRE∶REV∶VSVG 與干擾質(zhì)粒按照4.2∶2.1∶3.1∶4μg 混合，加入氯化鈉注射用水500μL 混勻，40μL 轉(zhuǎn)染試劑PEI 中同樣加入氯化鈉注射用水500μL 混勻，然后將兩者混合均勻，靜置15 min，加入293T 細(xì)胞中，72 h 后收上清，用0.45μm的濾膜過濾，得到的上清液即為包裝好的病毒，用于感染事先準(zhǔn)備好的穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白Flag-TPP1 的HT1080 細(xì)胞，其余的病毒分裝于EP 管中，-80℃凍存，用于反復(fù)感染細(xì)胞，直到感染效率達(dá)90%以上。

圖1 質(zhì)粒載體pll3.7的結(jié)構(gòu)圖譜

表1 根據(jù)人的TPP1基因設(shè)計的2對shRNA序列

1.5 TPP1的shRNA干擾效果檢測

1.5.1 檢測TPP1的shRNA的干擾效果[7]將穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白Flag-TPP1 的HT1080 細(xì)胞鋪到6 孔板中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度為60%～80%時進(jìn)行病毒感染，次日換液并再次感染，在倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。在慢病毒表達(dá)24和96 h后收取50%的細(xì)胞量，按如下程序進(jìn)行Western印跡檢測。

根據(jù)樣品蛋白分子量大小選擇合適濃度的SDS-PAGE 膠進(jìn)行電泳分離，電泳結(jié)束后將目的膠取下，用半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至NC 膜上，注意濾紙、膠和膜要剪成大小一致，防止短路，上層濾紙切勿接觸到下層濾紙，轉(zhuǎn)膜電壓和時間按照目的蛋白大小進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整；用5%脫脂奶粉（用1×TBST 配制）于室溫下?lián)u床封閉1 h 左右；加入用5%脫脂奶粉按一定比例稀釋的一抗，室溫輕搖1 h 或于4℃冰箱中過夜，1×TBST 洗膜3 次，每次5 min；加入用5%脫脂奶粉按一定比例稀釋的二抗，室溫輕搖1 h，1×TBST 洗膜3 次，每次5 min；按Thermo 公司的Western 印跡顯色試劑盒說明書進(jìn)行顯色2～3 min，壓片顯影。

1.5.2 檢測穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白Flag-Pot1 的端粒定位 將穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白Flag-Pot1 的HepG2 細(xì)胞鋪到6 孔板中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度為60%～80%時進(jìn)行感染病毒，次日換液并再次感染，在倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。在熒光蛋白表達(dá)量達(dá)到80%以上時消化細(xì)胞，鋪12孔板，按如下程序進(jìn)行免疫熒光試驗(yàn)[8]。

將消化好的細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM混勻后，接種到事先加入蓋玻片的12 孔板中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h 后觀察細(xì)胞密度，達(dá)到70%～80%后取出12 孔板，棄DMEM 培養(yǎng)液，用1×PBS 洗1 次；每孔加入500μL 4%多聚甲醛，室溫固定10 min，棄固定液；每孔加入500μL 封閉液，室溫?fù)u床上振蕩30 min，棄封閉液，1×PBS 洗3 次，每次5 min；按抗體說明書的要求，用1×PBS 稀釋一抗，每片蓋玻片孵25～30μL 稀釋抗體，于37℃恒溫孵育箱中結(jié)合1 h 或在4℃冰箱中過夜，在避光條件下用1×PBS 洗膜3 次，每次5 min；用1×PBS 按照一定比例稀釋DAPI，每孔加入500μL 染核液，避光染核5～10 min，熒光顯微鏡下觀察染色情況。

2 結(jié)果

2.1 TPP1的shRNA序列設(shè)計

根據(jù)人的TPP1序列設(shè)計4 條shRNA 序列（表1），經(jīng)BLAST 分析人基因數(shù)據(jù)庫序列，TPP1-si1和TPP1-si2 未發(fā)現(xiàn)同源序列，說明設(shè)計的序列特異性良好。

2.2 TPP1 shRNA干擾載體的鑒定

按前述構(gòu)建方法構(gòu)建出逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的shTPPl 質(zhì)粒，分別命名為pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2。pll3.7 空載體上有EcoRⅠ酶切位點(diǎn)（第4431 位堿基），同時用EcoRⅠ和HpaⅠ（第2935 位堿基）進(jìn)行酶切時，可以切下1500 bp 左右的片段，而所構(gòu)建的干擾質(zhì)粒在設(shè)置酶切位點(diǎn)時被削掉一個堿基，載體與片段連接后無法再被識別，使得pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2 質(zhì)粒不能被HpaⅠ識別，而只被EcoRⅠ識別，單酶切成線性DNA。鑒定結(jié)果如圖2，表明外源片段shRNA 序列TPP1-si1和TPP1-si2 已插入pll3.7 載體。將測序結(jié)果與原設(shè)計的序列用DNAMAN 軟件進(jìn)行比對，匹配率為100%，表明正確插入了外源片段序列。

2.3 pll-shRNA抑制TPP1蛋白表達(dá)的效果檢測

用構(gòu)建的干擾質(zhì)粒及空載體pll3.7 進(jìn)行慢病毒的制備，轉(zhuǎn)染效率如圖3 所示。將制備的慢病毒pll3.7、pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2 感染高表達(dá)外源性TPP1 蛋白的HT1080 細(xì)胞，分別在表達(dá)后24和96 h 收細(xì)胞進(jìn)行Western 印跡，結(jié)果用PhotoShop 7.0 軟件分析（圖4），設(shè)計的2 條shRNA 對TPP1 都有不同程度的抑制效果，且抑制效果隨感染時間的延長而增強(qiáng)，24 h的抑制效果分別為34.88%、30.59%，96 h 的抑制效果分別為70.56%、67.71%，其中pll-TPP1-si1對TPP1蛋白表達(dá)的抑制效果最好。

圖2 干擾質(zhì)粒雙酶切鑒定的瓊脂糖電泳

圖3 空載體pll（A）和shRNA序列（B）對293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率

2.4 shRNA 敲低TPP1 蛋白表達(dá)水平后，檢測穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白Pot1的端粒定位

圖4 Western印跡檢測pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2病毒對高表達(dá)外源TPP1的HT1080細(xì)胞的抑制效果

圖5 熒光觀察空載體pll和pll-TPP1-si1病毒對HepG2細(xì)胞的感染效率

選取抑制效果好的pll-TPP1-si1 病毒，以空載體pll 慢病毒為對照，感染穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白Flag-Pot1的HepG2細(xì)胞，多次感染直到感染效率達(dá)80%～90%時（圖5）將細(xì)胞鋪到12 孔板中，24 h 后進(jìn)行免疫熒光試驗(yàn)，結(jié)果如圖6。相關(guān)研究報道端粒蛋白Pot1 進(jìn)入細(xì)胞核及端粒定位需要TPP1 的介導(dǎo)[9]。感染空載體pll和pll-TPP1-si1慢病毒的試驗(yàn)組HepG2細(xì)胞在綠色熒光下呈現(xiàn)綠色熒光。Pot1由于內(nèi)源性TPP1 受到抑制，使得Pot1 能入核，但無法端粒定位，在紅色熒光下觀察不到端粒的點(diǎn)狀聚集；而對照組由于不帶有TPP1shRNA 干擾序列，不能抑制內(nèi)源TPP1 的表達(dá)水平，從而不影響Pot1 進(jìn)入細(xì)胞核并端粒定位，在紅色熒光下觀察到有紅色點(diǎn)狀聚集。以上免疫熒光分析表明構(gòu)建的pll-TPP1-si1 干擾質(zhì)粒能有效抑制內(nèi)源性TPP1的表達(dá)。

3 討論

腫瘤細(xì)胞中的端粒及端粒結(jié)合蛋白一直是研究熱點(diǎn)之一。有研究報道，端粒在確?；蚪M的穩(wěn)定性和完整性上至關(guān)重要[10]，端粒內(nèi)穩(wěn)態(tài)在癌癥治療，尤其是放射治療方面具有很好的潛能[11]。哺乳動物細(xì)胞通過端粒特有的蛋白可以區(qū)分正常染色體末端，使其不被識別為損傷的DNA 而誘發(fā)ATM（ataxia-telangiectasia mutated）或ATR（ataxia-telangieetasia and Rad3 related）介導(dǎo)的DNA 損傷反應(yīng)，出現(xiàn)DNA 損傷蛋白53BPl和γ-H2AX 在端粒的聚集，導(dǎo)致細(xì)胞增殖衰竭或凋亡[12]。

端粒蛋白TPP1 在Pot1 功能調(diào)控上具有多層次意義，涉及Pot1入核、入核后的端粒定位及Pot1到達(dá)端粒后最終發(fā)揮功能等多個過程步驟[5]。Pot1 蛋白在端粒上具有重要的功能，能夠保護(hù)和決定染色體DNA的5′端序列[13]。RNA干擾敲低Pot1后會導(dǎo)致端粒延長，出現(xiàn)染色體的不穩(wěn)定性[14]，TPP1敲低后也會出現(xiàn)類似現(xiàn)象，并抑制Pot1 募集到端粒[15]。Pot1 與TPP1 相互作用能夠調(diào)控端粒酶到達(dá)染色體末端，并且保護(hù)端粒免受DNA 損傷[4]。而且，也有體外試驗(yàn)表明Pot1 與TPP1 相互作用能增強(qiáng)端粒酶的合成能力[16]。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞在分裂增殖過程中保持穩(wěn)定的端粒長度，進(jìn)行持續(xù)分裂[17]。因而，在腫瘤細(xì)胞中通過敲低端粒蛋白來誘導(dǎo)其端粒功能障礙有可能成為一種新的治療方案。

圖6 免疫熒光觀察穩(wěn)定表達(dá)Flag-Pot1的HepG2細(xì)胞感染pll和pll-TPP1-si1病毒

我們采用shRNA 設(shè)計原則構(gòu)建出2 個抑制TPP1基因的shRNA 干擾載體，Western 印跡初步鑒定能夠有效抑制TPP1蛋白的表達(dá)，并且在穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白Flag-Pot1 的HepG2 細(xì)胞中進(jìn)行了功能驗(yàn)證，免疫熒光結(jié)果表明感染pll-TPP1-si1 病毒的細(xì)胞由于內(nèi)源TPP1蛋白受到抑制，從而導(dǎo)致其介導(dǎo)的Pot1 不再端粒定位?？傊?，本試驗(yàn)為后期探討TPP1的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

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