共表達(dá)siat7e和st3galⅠ基因MDCK細(xì)胞株的建立

張啟龍，陳小云，王 棟

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

采用哺乳動物細(xì)胞系生產(chǎn)流感疫苗工藝因具有無外源因子污染、純度高、安全性好［1］等特性，逐漸替代了傳統(tǒng)的雞胚生產(chǎn)工藝。其中MDCK細(xì)胞具有易培養(yǎng)、增殖快、流感病毒易感等特點(diǎn)，被作為流感病毒疫苗生產(chǎn)的重要細(xì)胞系之一［2］。

研究［3］發(fā)現(xiàn)，siat7e(ST6GALNacⅤ)是控制細(xì)胞貼壁程度的重要基因之一，其編碼的蛋白屬于α－2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶家族成員，該基因表達(dá)水平的增加將降低細(xì)胞貼壁程度。St3galⅠ(beta－galactoside alpha－2，3－sialyltransferase I)基因編碼β－半乳糖苷α－2，3唾液酸轉(zhuǎn)移酶I，可催化唾液酸與半乳糖以α－2，3連接形式［4］構(gòu)成流感受體組分，提高宿主細(xì)胞對流感病毒的敏感性。本文擬構(gòu)建共表達(dá)siat7e和st3galⅠ基因的MDCK細(xì)胞株，以圖同步解決MDCK細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)及提高流感病毒敏感性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與載體 MDCK細(xì)胞來自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心;Top 10感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技(北京)有限公司;pMD18－T載體購自寶生物工程(大連)有限公司;攜帶eGFP和siat7e、st3galⅠ基因的真核表達(dá)載體 pReceiver－siat7e－st3galⅠ［5］及pCMV－GFP載體，本室構(gòu)建保存。

1.2 主要試劑 細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒(DP430)、質(zhì)粒小提試劑盒為天根(北京)生化科技有限公司產(chǎn)品;Taq DNA聚合酶、DL－2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、Premix Ex TaqTM等為寶生物(大連)有限公司產(chǎn)品;氨芐青霉素、瓊脂糖凝膠為Sigma公司產(chǎn) 品;Lipofectamine?2000 Transfection Reagent、DMEM、G418為 Invitrogen公司產(chǎn)品;DIG Glyan Differentiation Kit、Anti－ digoxigenin － rhodamine 為Roche公司產(chǎn)品。

1.3 siat7e和st3galⅠ基因擴(kuò)增方法擴(kuò)增引物如下:siat7e－F:5’－TTACTCGCCACAAGATGCTG －3’，siat7e－R:5’－GCACCATGCCATAAACATTG －3’;st3galⅠ－F:5’－ GGTGACCCTGCGGAAGAG －3’，st3galⅠ－R:5’－GATTTTATTGATGGAGGC －3’;反應(yīng)體系為 premix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 9.5 μL;反應(yīng)條件為94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 70 s，33 個循環(huán);72 ℃ 10 min。

1.4 轉(zhuǎn)染與克隆 待細(xì)胞長滿，用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，用含1%FBS的培養(yǎng)基終止消化離心并棄去上清加入PBS重懸細(xì)胞，重復(fù)洗滌2～3次，最后將細(xì)胞重懸于電轉(zhuǎn)緩沖液 106cells/90 μL，將載體質(zhì)粒的濃度調(diào)整到1 μg/μL，吸取90 μL 細(xì)胞和10 μL質(zhì)粒充分混勻，將混合液移入0.2 mm電擊杯，150 V 5 ms電擊后將混合液移入6孔板24 h后換液，用含0.8 mg/mL G418的培養(yǎng)基篩選，每3日換液，持續(xù)G418篩選2周，可見有抗性細(xì)胞生長。對陽性細(xì)胞采用有限稀釋法，鋪于96孔板，每3～4日換1次液篩選2周，挑選生長狀態(tài)良好的單克隆細(xì)胞，繼續(xù)用有限稀釋法篩選單個能穩(wěn)定表達(dá)雙基因的細(xì)胞株，鑒定為陽性的細(xì)胞用胰酶消化后擴(kuò)大培養(yǎng)并采用常規(guī)方法凍存細(xì)胞。另取消化后的細(xì)胞，按上述方法同步轉(zhuǎn)染pCMV－GFP載體作為陽性對照。

1.5 陽性克隆的篩選鑒定 挑取14個生長狀態(tài)良好的陽性細(xì)胞克隆按細(xì)胞總RNA提取試劑盒說明書提取各個單細(xì)胞克隆總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以 cDNA 為模板，siat7e－F、siat7e－R、st3galⅠ－F、st3galⅠ－R為引物，進(jìn)行RT－PCR鑒定。

1.6 高表達(dá)細(xì)胞株的篩選

1.6.1 熒光定量 PCR 篩選 對1.5中siat7e、st3galⅠ基因RT－PCR擴(kuò)增結(jié)果均為陽性的細(xì)胞克隆用熒光定量PCR進(jìn)行篩選。同時用GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行定量分析。引物與PCR方法如下:

對 1.5 中 siat7e、st3galⅠ基因 RT －PCR 擴(kuò)增結(jié)果均為陽性的細(xì)胞克隆用相對熒光定量PCR的方法進(jìn)行檢測。每個樣品作3個平行對照，同時以超純水代替cDNA模板作空白對照，以母本MDCK細(xì)胞制備的cDNA作陰性對照。反應(yīng)體系:模板1 μL，引物 0.6 μL，Probe 0.4 μL，Mixture 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL;反應(yīng)循環(huán)條件:95℃ 5 min;95℃ 30 s，65℃ 30 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，直接由軟件7500 FAST software(ABI公司)計(jì)算出Ct值。取3個重復(fù)樣品的平均值，以GAPDH作為內(nèi)參基因，計(jì)算得到目的基因的相對變化倍數(shù)(2－ΔΔCt)。1.6.2 流式細(xì)胞術(shù)篩選 MDCK與陽性細(xì)胞克隆株分別鋪于6孔板，各鋪3個孔。待細(xì)胞長至90%滿時(每孔細(xì)胞約為1.5×106)，胰酶消化，分別收集每孔細(xì)胞，加1%FBS的DMEM培養(yǎng)液0.5 mL中和胰酶活性，1000 r/min離心10 min，棄上清，收集細(xì)胞沉淀，用含10 mmol/L Glycine的PBS洗2次，再用 Buffer 1(50 mmol/L Tris－HCl、0.15 mol/L NaCl、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L MnCl2、1 mmol/L CaCl2，pH 7.5)洗1次。將配置好的10×Blocking Solution 用 TBS(0.05 mol/L Tris － HCl、0.15 mol/L NaCl，pH 7.5)稀釋10倍，然后用稀釋好的封閉液均勻重懸細(xì)胞沉淀，在冰上封閉1 h。之后按上述方法重復(fù)洗滌步驟，再分別用高麗槐黃柏甙凝集素(maackia amurensis agglutinin，MAA)、黑接骨木果凝集素(sambucusnigra agglutinin，SNA)及空白對照(即不加一抗)同樣處理MDCK與陽性細(xì)胞克隆株，即1 μL 一抗(或不加)于30 μL Buffer 1 中均勻重懸細(xì)胞沉淀，冰上孵育1 h。重復(fù)洗滌步驟，再用1 μL Anti－digoxigenin －rhodamine于 30 μL Buffer 1中均勻重懸細(xì)胞沉淀，冰上孵育1 h，最后PBS洗滌3次后用于流式檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光觀察結(jié)果 采用Olympus IX71倒置熒光顯微鏡，通過觀察載體自帶的eGFP熒光蛋白的表達(dá)情況，驗(yàn)證外源基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，陽性對照出現(xiàn)明顯的綠色熒光，攜帶 pReceiversiat7e－st3galⅠ真核表達(dá)載體的MDCK陽性克隆也觀察到綠色熒光信號，表明轉(zhuǎn)染成功(圖1)。

2.2 陽性克隆篩選結(jié)果 用RT－PCR對14個克隆進(jìn)行擴(kuò)增鑒定，結(jié)果只有 B3－1、C5、D5、S5－1、CV9 5個克隆兩基因擴(kuò)增均為陽性(圖2)。

圖2 陽性細(xì)胞siat7e和st3galⅠ基因鑒定結(jié)果

2.3 熒光定量篩選高表達(dá)細(xì)胞株 為選擇雙基因均高表達(dá)的單細(xì)胞克隆株，對RT－PCR條帶較亮的5株細(xì)胞進(jìn)行相對熒光定量檢測。以CV9細(xì)胞克隆為參照，以MDCK為陰性對照，以GAPDH基因作為內(nèi)參基因，經(jīng)ABI FAST 7500檢測B3－1、C5、D5、S5 －1、CV9 細(xì)胞克隆 siat7e和 st3galⅠ基因的表達(dá)，結(jié)果表明，siat7e、st3galⅠ在5株細(xì)胞中均有表達(dá)，其中C5細(xì)胞株雙基因的表達(dá)水平顯著高于其他4株(P＜0.05)(圖3)。

圖3 相對熒光定量篩選結(jié)果

2.4 流式檢測結(jié)果 為了檢測siat7e和st3galⅠ基因在改造MDCK細(xì)胞上的蛋白表達(dá)含量，使用地高辛標(biāo)記的兩種凝集素作為一抗檢測α－2，3及α－2，6連接型受體的表達(dá)量:SNA特異性識別2，6連接型唾液酸，MAA特異性識別2，3連接型唾液酸。羅丹明標(biāo)記抗地高辛抗體為二抗。

挑選2.3中熒光定量PCR檢測基因相對表達(dá)量較高的兩個克隆C5和B3－1進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測，同步用未轉(zhuǎn)染載體的MDCK細(xì)胞作為對照。結(jié)果顯示B3－1細(xì)胞克隆SNA、MAA處理后平均熒光值較MDCK對照無顯著差異，C5細(xì)胞克隆SNA處理后平均熒光值由13019變?yōu)?4554，siat7e基因蛋白水平表達(dá)差異顯著(P＜0.05);MAA處理后平均熒光值由7307變?yōu)?3439，st3galⅠ基因蛋白水平表達(dá)差異顯著(P＜0.05)。從RT－PCR鑒定到流式細(xì)胞檢測細(xì)胞已傳12代，結(jié)果表明成功篩選到雙基因穩(wěn)定高表達(dá)的細(xì)胞克隆株(圖4)。將C5和B3－1克隆分別命名為MDCK－C5和MDCK－B3－1細(xì)胞株。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測C5、B3-1陽性細(xì)胞克隆和MDCK細(xì)胞對不同連接型特異性凝集素的反應(yīng)性

3 討論

本試驗(yàn)采取相對定量的方法來分析基因的表達(dá)量，以消除由于樣品不同導(dǎo)致的mRNA表達(dá)水平的差異，本研究采用看家基因GAPDH作為內(nèi)參基因?qū)λ袠悠愤M(jìn)行歸一化處理，采用△△Ct方法分別對不同細(xì)胞克隆株的雙基因表達(dá)情況進(jìn)行相對定量。然后采用流式細(xì)胞檢測技術(shù)篩選出雙基因表達(dá)量均最高的MDCK－C5細(xì)胞克隆株。

基因在mRNA水平的表達(dá)不能完全反映蛋白水平的表達(dá)，如本試驗(yàn)中MDCK－B3－1細(xì)胞株用熒光定量PCR方法證明mRNA轉(zhuǎn)錄水平高，但在蛋白表達(dá)水平檢測時與陰性MDCK細(xì)胞差異不顯著。

Chia Chu等將人的siat7e基因轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞，經(jīng)懸浮馴化成功獲得了適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的轉(zhuǎn)siat7e基因的 MDCK 細(xì)胞系［6］。曹文雁等［4］成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)st3galⅠ基因的MDCK細(xì)胞系，其α－2，3連接型受體的豐度顯著高于MDCK細(xì)胞，部分禽流感病毒分離株在MDCK－st3galⅠ上形成的蝕斑數(shù)量更多、面積更大、形態(tài)更為清晰，生長滴度更高。但這些研究構(gòu)建的細(xì)胞系均是單一表達(dá)siat7e基因或st3galⅠ基因。本文通過將真核表達(dá)載體pReceiver－siat7e－st3galⅠ電擊轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞后，成功觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，證實(shí)該載體已成功轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中并成功表達(dá)，通過相對熒光定量PCR和流式細(xì)胞檢測技術(shù)成功篩選到1株雙基因穩(wěn)定共表達(dá)的細(xì)胞株。

當(dāng)前MDCK細(xì)胞是培養(yǎng)和分離流感病毒的最佳哺乳動物細(xì)胞系之一，但工業(yè)生產(chǎn)上大多采用貼壁或微載體懸浮培養(yǎng)，工藝繁瑣易污染，由于MDCK細(xì)胞貼壁性能很強(qiáng)很難實(shí)現(xiàn)純懸浮培養(yǎng)。該試驗(yàn)在國內(nèi)外首次篩選到siat7e和st3galⅠ基因共表達(dá)細(xì)胞株，為下一步獲得適應(yīng)懸浮培養(yǎng)和對流感更易感的MDCK細(xì)胞株奠定了基礎(chǔ)，為MDCK細(xì)胞大規(guī)模純懸浮低成本生產(chǎn)流感疫苗作了有益的探索。

［1］ Genzel Y，Reichl U.Continuous cell lines as a production system for influenza vaccines［J］.Expert Rev Vaccines，2009，8:1681－1692.

［2］ Manufacturing of vaccines－cell culture technology gradually replacing egg － based manufacturing［R］.GBI Research Report，2011.

［3］ Jaluria P，Chu C，Betenbaugh M，et al.Cells by design:a minireview of targeting cell engineering using DNA microarrays［J］.Molecular Biotechnology，2008，39(2):105 －111.

［4］ 曹文雁.穩(wěn)定表達(dá)雞st3galⅠ的MDCK細(xì)胞系的建立［D］.北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2008.

［5］ 陳小云，張 敏，張啟龍，等.siat7 e基因和st3galⅠ基因雙表達(dá)載體的構(gòu)建及其初步應(yīng)用［J］.中國獸藥雜志，2013，47(4):6－9.

［6］ Chu C，Lugovtsev V，Golding H，et al.Conversion of MDCK cell line to suspension culture by transfecting with human siat7e gene and its application for influenza virus production［J］.PNAS，2009，106:14802－14807.