犬細(xì)小病毒膠體金檢測(cè)試紙條的制備與初步評(píng)價(jià)

劉 潔，牟林琳，何文輝，李晶梅，謝紅玲，廖園園，朱 薇，漆世華，溫文生

(武漢中博生物股份有限公司，武漢430070)

犬細(xì)小病是由犬細(xì)小病毒(CPV)引起的一種急性、以出血性腸炎或非化膿性心肌炎為主要特征的犬科和鼬科動(dòng)物的重要傳染?。?］。我國(guó)已建立的用于檢測(cè)CPV抗體的血清學(xué)方法有血凝試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)等，但是由于CPV與貓泛白細(xì)胞減少癥病毒、水貂腸炎病毒三者之間能發(fā)生交叉血清學(xué)反應(yīng)，因此在實(shí)際應(yīng)用中這些方法常受到限制。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)可檢測(cè)CPV抗原，也可檢測(cè)CPV抗體;PCR檢測(cè)敏感性高，特異性強(qiáng)，可分辨野毒感染和疫苗免疫，但這兩種技術(shù)都需要特殊的儀器設(shè)備。利用膠體金標(biāo)記單克隆CPV表面抗體，制成檢測(cè)CPV抗原的膠體金檢測(cè)試紙條敏感性高，特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，操作簡(jiǎn)便快速，結(jié)果易于分析判定［2］。

本研究利用膠體金免疫層析技術(shù)，成功研制出犬細(xì)小病毒膠體金免疫層析快速檢測(cè)試紙條，對(duì)CPV抗原的快速檢測(cè)對(duì)防控該病及流行病學(xué)調(diào)查有較大的輔助作用。

1 材料與方法

1.1 材料 氯金酸購(gòu)自天津光復(fù)精細(xì)化工研究所;檸檬酸三鈉購(gòu)自AMRESCO;抗犬細(xì)小病毒單抗(CPV－F1和CPV－B6)由武漢中博生物股份有限公司制備保存［3］;羊抗小鼠IgG二抗購(gòu)自博士德公司;樣品墊、金標(biāo)墊、NC膜購(gòu)自上海捷寧生物科技有限公司;犬細(xì)小病毒(CPV)，VR－2209和犬瘟熱病毒(CDV)，VR－1587購(gòu)自ATCC;犬用狂犬病毒滅活苗購(gòu)自英特威;5份犬細(xì)小病毒抗原樣品(血凝試驗(yàn)檢測(cè)陽(yáng)性)、10份健康犬糞便樣品(血凝試驗(yàn)檢測(cè)陰性)均采自寵康動(dòng)物診所接診寵物狗，60份與進(jìn)口商品化犬細(xì)小病毒抗原檢測(cè)試紙對(duì)比樣品由寵康動(dòng)物診所提供;韓國(guó)進(jìn)口試紙條購(gòu)自韓國(guó)安捷，貨號(hào)RG11－01。

1.2 方法

1.2.1 犬細(xì)小病毒抗原檢測(cè)試紙條的制備［4］

1.2.1.1 膠體金的制備 采用檸檬酸三鈉還原法［4］制備粒徑為25 nm的膠體金溶液。

1.2.1.2 膠體金的標(biāo)記 量取膠體金溶液20 mL，調(diào)pH值至9.0，攪拌加入抗犬細(xì)小病毒單克隆抗體CPV－F1 0.08 mg攪拌30 min，再加入終濃度20%的PEG－20000穩(wěn)定未結(jié)合的膠體金顆粒，8700 r/min離心30 min，棄上清，再用金標(biāo)緩沖溶液定容至2 mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3 金標(biāo)墊的制備 標(biāo)記好的膠體金溶液均勻涂布于金標(biāo)墊上，37℃烘干2 h備用。

1.2.1.4 質(zhì)控線和檢測(cè)線的包被 將羊抗小鼠IgG二抗和抗犬細(xì)小病毒單克隆抗體CPV－B6分別包被于硝酸纖維素膜作為質(zhì)控線和檢測(cè)線，37℃烘干2 h備用。

1.2.1.5 犬細(xì)小病毒抗原檢測(cè)試紙的制備 將制備好的硝酸纖維素膜、金標(biāo)墊、樣品墊和吸水紙依次粘貼于背襯板上，切條機(jī)切割成4 mm條，裝入卡殼，封裝于裝有干燥劑的鋁箔袋中。2～28℃保存?zhèn)溆茫?］。

1.2.2 樣品檢測(cè)和判定標(biāo)準(zhǔn)［6］將沾有犬糞便的取樣棉簽插入稀釋液中攪拌均勻，靜置片刻取上清液(80～120 μL，滴管 3～4滴)緩慢滴加到加樣孔中，將試紙卡平放，10 min觀察結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)如圖1:若在試紙條上出現(xiàn)兩條紅色的條帶(檢測(cè)線和質(zhì)控線)，則為陽(yáng)性結(jié)果。若在試紙條上只在質(zhì)控線處出現(xiàn)一條紅色的條帶則為陰性結(jié)果。若質(zhì)控線處不出現(xiàn)紅色的條帶則試紙失效。

1.2.3 陽(yáng)性參考樣品的制備［3］犬細(xì)小病毒(VR－2209)接種到已長(zhǎng)成單層的 F81細(xì)胞上，37℃培養(yǎng)72 h后，收取培養(yǎng)液。加入1%硫柳汞，使其終濃度為0.01%，加入二乙烯亞胺(BEI)使其終濃度為5 mmol/L，37℃滅活16 h，加入終濃度5 mmol/LNa2S2O3中和 BEI，10000 r/min 2 ～8 ℃離心30 min，去除細(xì)胞碎片，取上清液。將上述上清液分裝1 mL/支，－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 犬細(xì)小病毒抗原檢測(cè)膠體金試紙條結(jié)果判定示意圖

1.2.4 試紙條質(zhì)量的評(píng)估［7］

1.2.4.1 特異性 用制備好的犬細(xì)小病毒抗原檢測(cè)試紙條檢測(cè)5份犬細(xì)小病毒抗原樣品、10份健康犬糞便樣品、犬瘟熱病毒樣品1份、狂犬病毒滅活疫苗樣品1份。觀察檢測(cè)結(jié)果。

1.2.4.2 敏感性 將犬細(xì)小病毒陽(yáng)性參考樣品做22～215倍比稀釋?zhuān)弥苽浜玫娜?xì)小病毒抗原檢測(cè)試紙條進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)將同一陽(yáng)性參考樣品做21～212倍比稀釋?zhuān)霾《狙囼?yàn)(HA)［8］作為對(duì)照，評(píng)價(jià)試紙條的敏感性。

1.2.4.3 與進(jìn)口商品化犬細(xì)小病毒抗原檢測(cè)試紙的符合率 對(duì)60份待檢樣品分別用制備的犬細(xì)小病毒抗原檢測(cè)試紙條與韓國(guó)進(jìn)口犬細(xì)小病毒檢測(cè)試紙條同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 特異性試驗(yàn) 結(jié)果見(jiàn)圖2。犬細(xì)小病毒檢測(cè)試紙條檢測(cè)5份犬細(xì)小病毒陽(yáng)性糞便樣品均為陽(yáng)性，檢測(cè)10份健康犬糞便樣品均為陰性，同時(shí)不與犬瘟熱病毒和狂犬病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，說(shuō)明有較好的特異性。

圖2 特異性檢測(cè)結(jié)果

2.2 敏感性試驗(yàn) 本研究試紙條檢測(cè)陽(yáng)性參考樣品最低稀釋度為211(圖3)，而血凝試驗(yàn)檢測(cè)到陽(yáng)性參考樣品的血凝價(jià)為210(圖4)，兩種檢測(cè)結(jié)果表明犬細(xì)小病毒檢測(cè)試紙條比血凝試驗(yàn)敏感性高一倍。

2.3 符合率試驗(yàn) 同時(shí)用本研究制備的犬細(xì)小病毒抗原檢測(cè)試紙條和韓國(guó)進(jìn)口的犬細(xì)小病毒檢測(cè)試紙條對(duì)60份待檢樣品中的犬細(xì)小病毒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果(表1)表明，兩試紙條對(duì)待檢樣品的陽(yáng)性符合率為100%，陰性符合率為97.5%，總符合率為98%。

圖3 試紙條敏感性試驗(yàn)結(jié)果

圖4 間接血凝試驗(yàn)結(jié)果

表1 兩種試紙條檢測(cè)樣品對(duì)比結(jié)果

3 討論

本研究制備的試紙條與HA檢測(cè)同一陽(yáng)性樣品，檢測(cè)結(jié)果比HA高一倍，且操作簡(jiǎn)單、快速;與韓國(guó)進(jìn)口的試紙條進(jìn)行符合率檢驗(yàn)，結(jié)果表明陽(yáng)性符合率為100%，陰性符合率為97.5%，有一個(gè)陰性不符合的結(jié)果，但經(jīng)PCR檢測(cè)，該樣品的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，推測(cè)該樣品含有的病毒量較低。

犬細(xì)小病毒病是犬常見(jiàn)疾病，快速、準(zhǔn)確的診斷該病為治療該病提供有利的參考依據(jù)。膠體金免疫層析試紙條是目前確診該病的主要診斷方法，一般寵物醫(yī)院都會(huì)選用進(jìn)口產(chǎn)品。本研究制備的犬細(xì)小病毒抗原膠體金檢測(cè)試紙條具有敏感性高、特異性好等特點(diǎn)，對(duì)比進(jìn)口產(chǎn)品符合率也較高，可替代進(jìn)口產(chǎn)品使用，降低診斷成本，也可用于流行病學(xué)調(diào)查，為消除該疾病提供有效的輔助手段。

［1］ 殷 震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)［M］.第2版，北京:科學(xué)出版社，1997:736－750.

［2］ Pratelli A，Cavalli A，Martella V，et al.Canine parvovirus(CPV)vaccination:comparison of neutralizing antibody responses in pups after inoculation with CPV2 or CPV2b modified live virus vaccine［J］.Virology，2001，8(4):612 －615.

［3］ 劉 潔，何文輝，李晶梅，等.分泌抗犬細(xì)小病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立［J］.中國(guó)獸藥雜志，2013，47(7):9－12.

［4］ 劉文俊，王仲兵，鄭明學(xué)，等.免疫層析快速診斷試紙條的制備及在動(dòng)物疾病診斷中的應(yīng)用［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2009，11:8－10.

［5］ 劉 潔，夏興霞，王永山，等.大腸桿菌O157:H7抗體膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條的研制［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，32(5):375－378.

［6］ 劉宏偉，邱旭方，王俊朝，等.犬細(xì)小病毒膠體金免疫層析快速診斷試紙條的研制［J］.中國(guó)養(yǎng)犬雜志，2002，2(13):18－20.

［7］ 孫 洋，馮書(shū)章，郭學(xué)軍，等.腸出血性大腸桿菌O157膠體金免疫層析試紙條的研制［J］.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2008，24(4):356－359.

［8］ 秦海斌，張匯東，繆 勤，等.犬細(xì)小病毒血凝的檢測(cè)和血凝抑制試驗(yàn)方法的優(yōu)化［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19(7):49－52.