NO信號(hào)通過I－kappaB磷酸化激活人肝細(xì)胞內(nèi)源凝血因子Ⅷ重表達(dá)的調(diào)控作用

溫 泉，何玉霞，周云飛，王 娟，張 軍

（重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室 重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心，重慶 400016）

甲型血友病是因人凝血因子Ⅷ（human cogulation factorⅧ，F(xiàn)Ⅷ）缺乏引起的，也稱作甲型血友病或血友病A，是臨床上最常見的血友病。FⅧ是一個(gè)大的糖蛋白，在體內(nèi)生成過程中受多種因素影響，因此該基因的調(diào)控機(jī)制極其復(fù)雜，國(guó)內(nèi)外研究表明：不僅有內(nèi)部因素如轉(zhuǎn)錄、翻譯等參與FⅧ基因的調(diào)控，還包括外部因素如血管性假血友病因子（VWF）、一氧化氮（NO）和運(yùn)動(dòng)等均可參與其表達(dá)調(diào)控［1］。血友病是一種遺傳疾病，必須針對(duì)基因進(jìn)行治療才有可能根治。目前傳統(tǒng)治療仍停留在補(bǔ)充凝血因子來預(yù)防或治療血友病的出血癥狀［2］。精氨酸是一種α氨基酸，作為NO的前體，精氨酸可以協(xié)助舒張血管［3］。一氧化氮合酶（nitricoxide synthase，NOS）負(fù)責(zé)將精氨酸中的氮原子，在氧氣（O2）及其他輔助因素包括煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（triphosphopyridine nucleotide，NADPH）、黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucletide，F(xiàn)AD）、黃素單核苷酸（flavin mononucleotide，F(xiàn)MN）、原血紅素及四氫生物蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH4）存在的環(huán)境下合成NO［4］。由于NOS存在2種類型即結(jié)構(gòu)型和誘生型，肝細(xì)胞里存在誘生型，在內(nèi)毒素或細(xì)胞因子刺激下可產(chǎn)生NO［5］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)L－精氨酸在體內(nèi)通過誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）作用產(chǎn)生NO，進(jìn)而通過NO信號(hào)途徑使得I－κB磷酸化，釋放NF－κB進(jìn)入胞核，具有轉(zhuǎn)錄活性的NF－κB與FⅧ基因啟動(dòng)子結(jié)合啟動(dòng)FⅧ轉(zhuǎn)錄表達(dá)，為臨床治療甲型血友病以及凝血功能障礙提供新的靶點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑 人正常肝細(xì)胞L02為重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室保存；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，RPMI－1640購(gòu)自Hyclone公司，Trizol試劑購(gòu)自Takara公司，逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Promega公司，PCR Mix購(gòu)自東盛生物技術(shù)公司，兔抗人GAPDH單克隆抗體和兔抗人磷酸化I－kappa－B單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司，HRP標(biāo)記的鼠抗兔IgG和FITC標(biāo)記的小鼠抗人FⅧ抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期L02細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板中（4.0×105細(xì)胞／孔），分為無處理的對(duì)照組、加藥組、抑制劑組和抑制劑對(duì)照組。待L02細(xì)胞貼壁后經(jīng)PBS洗滌2次，加藥組加入含L－精氨酸（終濃度為15mmol·L－1）的 RPMI－1640培養(yǎng)基2mL，對(duì)照組用同體積的滅菌水取代L－精氨酸，抑制劑組加入含N－硝基－L－精氨酸甲酯（NG－nitro－L－arginine methyl ester，L－NAME）（終濃度為100μmol·L－1）RPMI－1640培養(yǎng)基1mL，3h后加入含 L－精氨酸（終濃度為15mmol·L－1）RPMI－1640培養(yǎng)基1mL，抑制劑對(duì)照組則只加入含L－NAME（終濃度為100μmol·L－1）RPMI－1640培養(yǎng)基2mL，分別培養(yǎng)12、24、36、48和60h后，收集細(xì)胞，凍存于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Griess法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NO水平 細(xì)胞處理：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰蛋白酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以1×104mL－1細(xì)胞密度鋪96孔板，分為對(duì)照組、加藥組、抑制劑組和抑制劑對(duì)照組，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)鋪4個(gè)孔，其中3個(gè)孔為實(shí)驗(yàn)孔，另一個(gè)孔為對(duì)照孔，對(duì)照孔與實(shí)驗(yàn)孔同等處理，但不加檢測(cè)試劑，調(diào)零孔不作任何處理，只加檢測(cè)試劑。12h貼壁后分別培養(yǎng)0、3、6、12、24、36、48和60h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)再用MTT同等處理來檢測(cè)細(xì)胞的增殖速度。到時(shí)間后MTT組加MTT試劑（用高壓滅菌后的去離子水配置成5g·L－1）20μL，細(xì)胞孵箱孵育4h，吸棄上清，每孔加150μL DMSO，搖床10min。酶標(biāo)儀比色（NO／570nm、MTT／490nm）。NO標(biāo)準(zhǔn)稀釋：精確稱量NaNO26.9mg，加去離子水定容至10mL，即為10mmol·L－1NaNO2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液。分別稀釋為濃度 （μmol· L－1）1000、100、50、25、12.5、6.25、3.125和1.560。加樣：各孔中分別加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液或待測(cè)樣品各50μL。向各孔中加入50μL試劑A，于37℃孵箱中反應(yīng)10min；向各孔中加入50μL試劑B，于37℃孵箱中反應(yīng)10min；將96孔板輕輕震蕩數(shù)次，待各孔反應(yīng)液完全混勻后，于540nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度（A）值；根據(jù)所得A值，擬合NO反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，并由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各待測(cè)樣品的NO水平。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FⅧ蛋白的表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的加L－精氨酸處理的細(xì)胞和正常組細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞2次，胰酶消化2min后加入等量含10%新生胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，使細(xì)胞濃度約為5×105mL－1即可；分別用Buffer清洗細(xì)胞3次，1200r·min－1離心10min后，棄去上清液；分別用Buffer重懸細(xì)胞成5×105／100μL的細(xì)胞懸液；分別加入FITC標(biāo)記的小鼠抗人FⅧ抗體（1∶50）和相同體積的PBS溶液各5μL，充分混勻后，避光，4℃冰箱孵育30min；取3mL Buffer洗滌細(xì)胞，1200r·min－1離心10min，棄上清，重復(fù)此步驟2次，適量Buffer重懸細(xì)胞，避光，以流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)L02細(xì)胞加藥組和對(duì)照組FⅧ蛋白的熒光亮度來表示蛋白的表達(dá)水平。

1.5 RT－PCR法檢測(cè)FⅧ及相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平用Trizol試劑分別提取對(duì)照組、加藥組、抑制劑組和抑制劑對(duì)照組0、12、24、36、48和60h時(shí)間點(diǎn)的L02細(xì)胞總RNA并定量和檢測(cè)純度，取4μg總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，反應(yīng)條件：70℃變性5min，42℃反應(yīng)60min。以cDNA鏈作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。20μL反應(yīng)體系：模板cDNA 0.2μL，上游引物0.2μL，下游引物0.2μL，PCR Mix 10μL，超純水9.4μL?；靹蚝笙鄳?yīng)條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)（PCR產(chǎn)物4℃保存）：各個(gè)基因反應(yīng)條件不一致，按各自反應(yīng)溫度進(jìn)行PCR，各基因反應(yīng)條件見表1；取擴(kuò)增產(chǎn)物5μL，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（2%，50min），用凝膠成像系統(tǒng)（Bio－Rad）成像，Quantity One軟件分析目的條帶灰度值，以目的條帶值與GAPDH灰度值比值表示mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

表1 引物序列和PCR條件Tab.1 Sequences of primers and PCR conditions

1.6 Western blotting檢測(cè)磷酸化I－κB 蛋白表達(dá)水平 抽提對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組、抑制劑組和抑制劑對(duì)照組0、12、24、36、48和60h時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞總蛋白，用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，取50μg蛋白與Loading Buffer煮沸變性，經(jīng)SDS－PAGE分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉37℃封閉3h；分別加入兔抗人GAPDH單克隆抗體 （1∶3000稀釋）和兔抗人磷酸化I－κB單克隆抗體（1∶2000稀釋），4℃水平搖床上過夜；再加入HRP標(biāo)記的鼠抗兔IgG （1∶5000），37℃作用2h；洗膜后ECL法顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃描，Quantity One軟件分析條帶A值，以目的條帶A值／GAPDH A值表示蛋白表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Origin 6.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組細(xì)胞的NO水平和FⅧmRNA、NF－κB1mRNA、I－κB mRNA 及 phosphorylate I－κB蛋白表達(dá)水平以表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人FⅧ蛋白表達(dá) 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到加L－精氨酸培養(yǎng)48h后L02中出現(xiàn)人FⅧ蛋白的表達(dá)。見圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)L－精氨酸作用后FⅧ蛋白表達(dá)Fig.1 Epressions of FⅧ protein after treated with L－arginine detected by flow cytometry

2.2 Griess法檢測(cè)L02細(xì)胞中NO水平 加藥組L02細(xì)胞中3、6和12h時(shí)NO表達(dá)水平分別為0.860±0.022、0.910±0.021和1.063±0.021，其表達(dá)水平隨L－精氨酸作用時(shí)間增加而增加，均高于對(duì)照組NO表達(dá)水平 （0.803±0.011）、抑制劑 （0.810±0.013）和抑制劑對(duì)照組 （0.806±0.013）（P＜0.05），24、36、48和60hNO表達(dá)水平又基本恢復(fù)到正常水平；RT－PCR法檢測(cè)顯示：對(duì)照組iNOS mRNA低水平表達(dá)，見圖2。

2.3 RT－PCR法檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄 加藥組L02中有人FⅧmRNA的轉(zhuǎn)錄，對(duì)照組、抑制劑組和抑制劑對(duì)照組均無人FⅧmRNA的轉(zhuǎn)錄，加藥組NF－κB和 I－κB alpha 轉(zhuǎn)錄水平均有上升（P ＜0.05），對(duì)照組、抑制劑組和抑制劑對(duì)照組上述基因轉(zhuǎn)錄水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。見圖3～5。

圖2 對(duì)照組iNOS mRNA表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expression of iNOS mRNA in blank control group

圖3 加藥組不同時(shí)間點(diǎn)FⅧmRNA轉(zhuǎn)錄水平電泳圖Fig.3 Electrophoregram of transcription levels of FⅧmRNA in experimental group at different time points

2.4 Western blotting法檢測(cè)磷酸化I－κB 蛋白表達(dá) 磷酸化I－κB加藥組0、12、24和36hFⅧ表達(dá)水平逐漸增加，36h表達(dá)水平最高，48和60h表達(dá)水平逐漸下降，恢復(fù)到正常表達(dá)水平，正常組和抑制劑組則無明顯變化。見圖6。

圖4 不同濃度抑制劑L－NAME抑制36h后FⅧ mRNA轉(zhuǎn)錄水平電泳圖Fig.4 Electrophoregram of transcription levels of FⅧmRNA in 36hafter treated with different does of L－NAME

3 討 論

Ingerslev等［2］發(fā)現(xiàn)：新鮮分離的人肝細(xì)胞能分泌FⅧ，Hollestelle等［3］研究發(fā)現(xiàn)：離體培養(yǎng)約30d的人肝細(xì)胞有合成和分泌FⅧ的能力，而長(zhǎng)期離開人體內(nèi)環(huán)境培養(yǎng)的肝細(xì)胞合成和分泌FⅧ的能力已經(jīng)減退。有報(bào)道［6－8］顯示：肝移植患者手術(shù)移植肝臟一段時(shí)間后，患者凝血水平出現(xiàn)顯著下降。本研究通過RT－PCR法檢測(cè)正常永生化的人肝細(xì)胞L02中FⅧ基因的mRNA轉(zhuǎn)錄情況，均無人FⅧ基因的mRNA轉(zhuǎn)錄。L－精氨酸是生成NO的前提物質(zhì)，在NOS的作用下，精氨酸生成NO和L－胍氨酸［9］。Griess法檢測(cè)L02細(xì)胞內(nèi)NO水平結(jié)果顯示：加藥組前期L－精氨酸通過細(xì)胞內(nèi)的NOS作用后，生成一定量的NO，并透過細(xì)胞壁擴(kuò)散進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，使得L02細(xì)胞內(nèi)NO水平升高，正常組、抑制劑組和抑制劑對(duì)照組L02細(xì)胞內(nèi)NO水平則穩(wěn)定的維持在一個(gè)恒定水平。本研究中RT－PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示：人肝細(xì)胞中有iNOS mRNA表達(dá)，說明在人肝細(xì)胞中存在的NOS為iNOS型。RT－PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：精氨酸刺激24h開始表達(dá)FⅧmRNA，36h達(dá)到最高，48和60h表達(dá)水平逐漸下降，最后趨于正常的本底表達(dá)。本研究通過軟件查找出FⅧ啟動(dòng)子上游1000bp轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，查找出FⅧ上游轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)NF－κB1。文獻(xiàn)［10］表明：L－精氨酸可以有效促進(jìn)FⅧA2結(jié)構(gòu)域基因啟動(dòng)，通過作用于A2結(jié)構(gòu)域基因內(nèi)部的某個(gè)調(diào)控元件，進(jìn)而增強(qiáng)人凝血FⅧ基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。RT－PCR結(jié)果顯示：加藥后NF－κB1和I－κB alpha基因的轉(zhuǎn)錄水平均有增加，而文獻(xiàn)［11］顯示：在靜息狀態(tài)下，NF－κB與其天然抑制因子I－κB結(jié)合存在于胞質(zhì)內(nèi)，對(duì)諸多靶基因不發(fā)揮調(diào)控作用；當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，I－κB被磷酸化，隨之被泛素化蛋白小體降解，釋放NF－κB進(jìn)入胞核，NF－κB結(jié)合于靶基因啟動(dòng)子上的順式作用元件，從而促使基因表達(dá)。當(dāng)加入精氨酸刺激細(xì)胞前3h加入L－NAME后，細(xì)胞恢復(fù)到正常狀態(tài)，不再表達(dá)FⅧ，轉(zhuǎn)錄因子NF－κB1表達(dá)水平也不再發(fā)生變化，維持恒定水平，說明細(xì)胞重表達(dá)FⅧ主要是L－精氨酸在iNOS作用下產(chǎn)生NO進(jìn)而活化NO信號(hào)通路引起的。NO是一種嗜脂性物質(zhì)，很容易透過細(xì)胞膜，直接擴(kuò)散和進(jìn)入靶細(xì)胞［12］。也有學(xué)者［13］認(rèn)為：NOS生成的NO可能先與含巰基的載體分子結(jié)合或形成硝基硫醇復(fù)合物，到達(dá)靶細(xì)胞后，NO從載體釋放并直接擴(kuò)散到靶細(xì)胞內(nèi)。進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)的NO與鳥苷酸環(huán)化酶中的血紅素成分 （Fe2＋）結(jié)合使之激活，產(chǎn)生cGMP，發(fā)揮生物效應(yīng)［14］。本文作者推測(cè)：L－精氨酸在iNOS作用下產(chǎn)生了NO，進(jìn)而通過NO－cGMP－PKG途徑使得cGMP－PKG途徑信號(hào)通路活化，通過一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)磷酸化I－κB，Western blotting檢測(cè)的磷酸化I－κB蛋白表達(dá)增加也為此推測(cè)提供了依據(jù)，而其中NO是如何通過NO－cGMP－PKG途徑使得I－κB磷酸化將是本課題組下一步研究的重點(diǎn)。

圖5 各組L02細(xì)胞中人FⅧ、NF－κB1和I－κB基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平電泳圖Fig.5 Electrophoregram of transcription levels of human FⅧ，NF－κB1and I－κB gene mRNA in L02cells in various groups

圖6 各組磷酸化I－κB蛋白表達(dá)電泳圖Fig.6 Electrophoregram of expressions of phosphorylated I－κB protein in various groups

綜上所述，L－精氨酸在人肝細(xì)胞內(nèi)通過iNOS作用產(chǎn)生NO，進(jìn)而通過NO信號(hào)通路最終使I－κB磷酸化，釋放NF－κB進(jìn)入胞核，具有轉(zhuǎn)錄活性的NF－κB與FⅧ基因啟動(dòng)子結(jié)合啟動(dòng)FⅧ轉(zhuǎn)錄表達(dá)，使得離體的永生化肝細(xì)胞L02重新啟動(dòng)表達(dá)FⅧ。

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