攜帶FLAG標簽的人BTG2真核表達載體的構建及其在HeLa細胞中的表達

趙金匣，王志平，陶 燕，賀振華，郭 琦，洪 梅

（蘭州大學第二醫(yī)院泌尿外科研究所 甘肅省泌尿系疾病研究重點實驗室甘肅省泌尿系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學中心，甘肅 蘭州 730030）

BTG2Pc3／Tis21是一個新發(fā)現(xiàn)的抗增殖基因，屬于BTG／TOB基因家族，實驗室和臨床研究［1］均表明BTG2可能是一個抑癌基因。BTG2在細胞周期調控、細胞生長與分化和DNA損傷修復等方面發(fā)揮著重要功能，該基因已被證實對多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有抑制作用［2－4］。最初 BTG2Pc3／Tis21基因是在大鼠Pc12嗜鉻細胞瘤株cDNA文庫中被發(fā)現(xiàn)的，Pc3是可被神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）特異誘導的具有抗增殖活性的蛋白。隨后，F(xiàn)letcher等在小鼠NIH3T3細胞中發(fā)現(xiàn)了相似的序列并將其命名為Tis21，Tis21能被腫瘤促進劑佛波酯（12－O－tetradecanoylphorbol－13－acetate，TPA）誘導，屬早期應答基因［5］。人BTG2基因最早是由Rouault等在尋找p53的靶基因時發(fā)現(xiàn)并克隆成功的，人BTG2基因位于人類染色體1q32區(qū)，編碼一個含有158個氨基酸的蛋白，蛋白N端含有一個高度保守的APRO功能結構域［6］。BTG2高表達于腎近端小管、肺泡支氣管上皮細胞和前列腺腺泡的基底細胞層［7］。研究［8］證明BTG2能被抑癌基因p53誘導而發(fā)生轉錄激活，并進一步參與細胞周期調控和DNA損傷應答。BTG2還能抑制細胞周期蛋白cyclin D1的轉錄，通過誘導G1期阻滯抑制細胞周期進展。目前的研究提示：BTG2發(fā)揮抗腫瘤作用的分子機制，主要是通過轉錄調控和mRNA降解途徑影響一系列腫瘤相關基因的表達，另外還可能通過蛋白質相互結合發(fā)揮作用，然而其具體的作用機制并不十分清楚。BTG2是一個新近發(fā)現(xiàn)的蛋白，能夠從生物公司購買到的抗體雖有不少種，但這些抗體的靈敏度和特異性都非常有限，應用效果欠佳。在缺乏有效抗體的情況下，為開展蛋白質功能研究，本課題組在BTG2的N端插入了一個FLAG標簽。FLAG是由8個氨基酸（NAsp－Tyr－Lys－Asp－Asp－Asp－Asp－Lys－C）組 成 的 親水性短肽，可標記于重組蛋白質的N端、C端或中心。FLAG標簽具有抗原性，能被抗FLAG抗體識別，因此帶FLAG標簽的目標蛋白就可通過Western blotting法和免疫熒光技術等方法進行方便的檢測。由于FLAG標簽很小，通常對目標蛋白的立體結構和生物活性不會產(chǎn)生影響，可幫助分析靶蛋白的生物學功能［9］。本實驗利用蛋白標簽的優(yōu)點，在 pcDNA3.1（＋）－BTG2質粒中插入了FLAG標簽，將質粒導入HeLa細胞系中，用標簽抗體檢測到了目標蛋白的表達，為進一步研究BTG2蛋白的功能奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器 HeLa細胞復蘇自本研究所凍存細胞，培養(yǎng)基和血清購自美國Hyclone公司。pcDNA3.1（＋）質粒購自美國Invitrogen公司，pSG5－BTG2質粒由意大利Perugia大學Francesco Grignani教授惠贈。DH5α感受態(tài)細胞、DNA Marker、氨芐青霉素和質粒提取試劑盒購自天根公司，Prime STAR HS DNA聚合酶、T4DNA連接酶和限制性核酸內切酶購自寶生物公司，引物合成及DNA測序由上海生物工程有限公司完成。Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司，蛋白Marker購自美國NEB公司，單克隆 ANTI－FLAG M2抗體購自美國Sigma公司。Odyssey封閉液和IRDye 800CW偶聯(lián)的羊抗鼠二抗購自北京北方儀濤商貿有限公司。DNA電泳槽和電泳儀為北京六一儀器公司產(chǎn)品，PCR儀、Western blotting所使用的電泳槽和半干轉印槽為美國Bio－Rad公司產(chǎn)品，Odyssey近紅外激光掃描成像儀為美國Li－Cor公司產(chǎn)品。

1.2 pcDNA3.1（＋）－BTG2載體的構建及鑒定由于pSG5載體表達效率比較低，而且沒有可供穩(wěn)定轉染使用的新霉素抗性基因，所以本研究以pSG5－BTG2質粒為模板，用PCR方法擴增出BTG2全長編碼序列，重新插入pcDNA3.1（＋）載體的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點之間。根據(jù)BTG2 mRNA序列（NM＿006763.2）的編碼區(qū)設計PCR引物，在上游引物中插入EcoRⅠ酶切位點（GAATTC）和 Kozak翻譯起始序列（GCCACC），在下游引物中插入XhoⅠ酶切位點（CTCGAG）。引物序列如下，BTG2－F：5′－ATAGAATTCGCCACCATGAGCCACGGGAAGGGAAC－3′，BTG2－R：5′－ATACTCGAGCTAGCTGGAGACTGCCATCACGTAG－3′。以pSG5－BTG2質粒為模板，用高保真Prime STAR HS DNA聚合酶進行PCR，PCR 反 應 條 件 為：98℃、10s，55℃、15s，72℃、1min，30個循環(huán)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證目的條帶后，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收BTG2目的片段。用EcoRⅠ和XhoⅠ分別雙酶切pcDNA3.1（＋）質粒和PCR產(chǎn)物，用T4DNA連接酶連接載體和插入片段。連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，從LA培養(yǎng)板挑取6個單克隆，于100μL LA培養(yǎng)基中培養(yǎng)2h，取1μL菌液在25μL體系中進行PCR鑒定，所用引物同上，選擇PCR陽性的菌種送公司測序。

1.3 在pcDNA3.1（＋）－BTG2載體中插入 FLAG標簽 設計Oligo DNA：根據(jù)FLAG的氨基酸序列設計2條互補的Oligo DNA，合成PAGE純化級DNA，2條鏈退火后插入pcDNA3.1（＋）－BTG2載體的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點之間。Oligo DNA序列如下，F(xiàn)LAG－top：5′－GATCGCCACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGG －3′，F(xiàn)LAG－bottom：5′－AATTCCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCATGGTGGC－3′。FLAG－top 包 含1個5′－BamHⅠ 酶 切 位 點 的 突 出 末 端 （5′－GATC）、Kozak翻譯起始序列（GCCACC）、起始密碼子（ATG）和 FLAG 編 碼 序 列 （GACTACAAGGACGACGATGACAAG），F(xiàn)LAG－bottom 包 含1個5′－EcoRⅠ酶切位點的突出末端（5′－AATTC）。將 pcDNA3.1（＋ ）－BTG2 載 體 用 BamH Ⅰ 和EcoRⅠ雙酶切，退火后的Oligo DNA其突出的黏性末端可連接于酶切后的載體。Oligo DNA的退火和連接：將2條互補Oligo DNA進行退火，先用TE溶解Oligo DNA至濃度為100μmol·L－1，然后將FLAG－top與FLAG－bottom溶液按1∶1混合（濃度為50μmol·L－1），退火條件為：95℃、30s，72℃、2min，37℃、2min，25℃、2min，冰上儲存。連接之前先用TE 1∶100稀釋退火Oligo至0.5μmol·L－1，連接反應體系如下：酶切載體 （25mg·L－1）2μL，退火 Oligo DNA（0.5μmol·L－1） 1 μL， BSA （10g·L－1）0.5μL，10× T4DNA 連接酶緩沖液1.5μL，T4DNA連接酶（400U·μL－1）0.5μL，無核酸酶水9.5μL，室溫連接3h，但不要長于3h，轉化前－20℃儲存。4μL連接產(chǎn)物轉化100μL感受態(tài)大腸桿菌DH5α后，在含氨芐青霉素的平板中篩選挑取菌落后抽提質粒。構建的載體用BamHⅠ酶切鑒定，酶切鑒定正確后進行DNA序列測定。

1.4 細胞培養(yǎng)與轉染 HeLa細胞在含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉染前1d將對數(shù)生長期的細胞接種于60mm（20cm2）培養(yǎng)皿中，使其在次日細胞融合達到90%，用PBS洗細胞2次，換用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。利用脂質體Lipofectamine 2000轉染試劑，將4μg質粒DNA或10μL Lipofectamine 2000分別加入250μL無血清培養(yǎng)基中混勻，5min后將二者混勻，靜置20min后加入HeLa細胞中。轉染過程用同等量的空載體質粒作為對照，轉染6h后更換含10%血清的培養(yǎng)基。

1.5 Western blotting法檢測 FLAG－BTG2蛋白表達 轉染后48h收集細胞，用RIPA裂解液抽提細胞總蛋白，13000g、4℃ 離心30min，取5μL上清進行蛋白定量。取40μg總蛋白經(jīng)10%SDS－PAGE凝膠分離，0.8mA·cm－2恒流30min轉移到硝酸纖維素膜上。用Odyssey封閉液封閉1h，一抗為 ANTI－FLAG（1∶1000 稀 釋）或ANTI－β－Actin（1∶500稀釋），一抗4℃孵育過夜。次日PBST洗膜3次，再與IRDye 800CW偶聯(lián)的羊抗鼠二抗（1∶5000稀釋）室溫孵育1h，然后PBST洗膜3次，采用Odyssey CLx紅外熒光掃描成像系統(tǒng)進行檢測，結果以蛋白表達強度表示。

2 結 果

2.1 pcDNA3.1（＋）－BTG2載體的構建與鑒定以pSG5－BTG2質粒為模板，用PCR法擴增出BTG2全長編碼序列，重新插入表達效率高且能穩(wěn)定轉染細胞的pcDNA3.1（＋）載體。為證實載體中是否已插入目的基因，以轉化pcDNA3.1（＋）和BTG2連接產(chǎn)物的菌液為模板，進行PCR鑒定（圖1）。圖1中P為陽性對照（以pSG5－BTG2為模板進行PCR），條帶1～6代表不同的菌落，可以看到在500bp處均有單一條帶，與理論值大小一致，說明各個載體均已插入BTG2片段。選取2個菌種進行DNA測序，結果表明1號克隆的序列與設計完全一致，說明pcDNA3.1（＋）－BTG2載體構建成功。

圖1 PCR法鑒定pcDNA3.1（＋）－BTG2質粒電泳圖Fig.1 Electrophoregram of pcDNA3.1（＋）－BTG2vector identified by PCR method

2.2 pcDNA3.1（＋）－FLAG－BTG2載體的構建及鑒定 為了表達FLAG－BTG2融合蛋白，本課題組在pcDNA3.1（＋）－BTG2載體中插入了一個FLAG標簽 （圖2）。首先根據(jù)FLAG的氨基酸序列設計并合成2條互補的Oligo DNA，序列設計如圖3所示，退火后Oligo DNA突出的黏性末端即可直接連接于酶切后的載體。為便于陽性克隆的鑒定，在設計Oligo DNA時，特別將BamHⅠ酶切位點最右端的一個堿基刪除 （圖3），這樣插入FLAG后載體中的BamHⅠ酶切位點即被破壞，故空載體能被BamHⅠ切開，而插入FLAG的載體無法被BamHⅠ切開 （圖3）。用BamHⅠ酶切所構建的載體，1～6號質粒均未切開，說明均已插入FLAG序列 （圖4）。酶切鑒定后，將1號和2號陽性克隆送寶生物公司進行DNA測序，測序結果顯示：2號克隆的DNA序列正確 （圖5），說明pcDNA3.1 （＋）－FLAG－BTG2載體構建成功。

圖2 pcDNA－3.1（＋）－FLAG－BTG2載體結構Fig.2 Structure of pcDNA－3.1（＋）－FLAG－BTG2vector

圖3 FLAG Oligo DNA設計Fig.3 Oligo DNA design of FLAG

圖4 pcDNA3.1（＋）－FLAG－BTG2質粒的 BamH Ⅰ酶切電泳圖Fig.4 Electrophoregram of pcDNA3.1（＋）－FLAG－BTG2 plasmid digested by BamHⅠ

2.3 Western blotting法檢測 FLAG－BTG2融合蛋白的表達 帶FLAG標簽的BTG2融合蛋白在HeLa細胞中能夠有效表達 （第3泳道），而第1泳道 （轉染空載體）和第2泳道 （轉染無FLAG標簽的BTG2表達質粒）沒有相應的條帶。融合蛋白的相對分子質量約為20000，與人BTG2蛋白的相對分子質量接近。Western blotting法檢測的結果表明：FLAG－BTG2融合蛋白在HeLa細胞中獲得了成功表達。見圖6。

3 討 論

圖5 pcDNA3.1（＋）－FLAG－BTG2載體DNA測序圖譜Fig.5 Sequencing of pcDNA3.1（＋）－FLAG－BTG2vector DNA

圖6 Western blotting法檢測FLAG－BTG2在HeLa細胞中的表達Fig.6 Expression of FLAG－BTG2in HeLa cells detected by Western blotting method

BTG2是BTG／TOB抗增殖基因家族的成員，研究［10－12］發(fā)現(xiàn)：BTG2在肺癌、乳腺癌和胃癌等多種腫瘤中表達水平較相鄰的癌旁組織降低，而且過表達BTG2則能抑制腫瘤細胞的增殖和轉移。當細胞發(fā)生DNA損傷、細胞分化和停止增殖等情況時，BTG2的表達會升高。BTG2還包含核受體LXXLL序列，能夠抑制雄激素受體 （androgen receptor，AR）介導的轉錄調控，明顯減緩前列腺癌細 胞 的 生 長 速 度［13］。維 甲 酸 （retinoic acid，RA）通過維甲酸受體 （retinoic acid receptor，RAR）控制造血細胞的分化，BTG2過表達能夠增加RARα的轉錄活性以及RA對白細胞的誘導分化作用。BTG2還參與p53－p21通路誘導的細胞復制性衰老 （replicative senescence），干擾BTG2的表達能夠延長成纖維細胞的壽命，這種作用是通過結合和拮抗細胞周期調控蛋白Pin－1完成的［14］。另外，在前列腺細胞中干擾BTG2的表達后，E－Cadherin陽性細胞明顯減少，細胞遷移能力升高，細胞出現(xiàn)上皮細胞－間充質轉化 （epithelial－mesenchymal transition， EMT） 的 特 征［15］。BTG2是生長因子或DNA損傷等信號通路的下游效應分子，其執(zhí)行著抑制細胞增殖和侵襲、促進細胞分化和衰老的功能。目前的研究已經(jīng)證明：BTG2的失活與腫瘤的發(fā)生和進展具有密切的關系，但是其發(fā)揮作用的分子機制并不十分清楚，因此研究BTG2的功能、揭示其靶基因和相互作用蛋白是亟待解決的問題，這將為腫瘤的診斷和治療提供新的策略。

蛋白標簽 （tag）是指通過DNA重組技術實現(xiàn)標簽多肽與目標蛋白 （target protein）的融合表達 （fusion protein），標簽有助于對目的蛋白進行方便的檢測或純化。常用的蛋白標簽有FLAG、HA、c－Myc、六聚組氨酸 （6×His）、谷胱甘肽巰基轉移酶 （GST）和增強型綠色熒光蛋白 （eGFP）等?？笷LAG M2抗體能夠用于在蛋白質印跡實驗中識別FLAG融合蛋白，或利用免疫沉淀（immunoprecipitation）技術捕獲FLAG融合蛋白，可用于研究蛋白質相互的作用。為了給BTG2的功能研究建立實驗基礎，本課題組在已構建好的BTG2表達載體中插入了FLAG標簽，構建了表達FLAG－BTG2融合蛋白的真核表達載體。除了本研究所采用的實驗方案外，帶標簽的表達載體也可以一次構建成功，但是一次完成構建通常需要合成很長的引物，引物過長則在合成DNA時容易出錯，導致最后構建完成的載體發(fā)生序列錯誤。而且，本實驗所使用的方法同樣適用于在空載體或其他目的基因的表達載體中插入各種短小標簽 （如c－myc、HA和6×His等）。由于插入的FLAG標簽序列非常短小，無法用常規(guī)的雙酶切方法進行鑒定，所以在設計Oligo DNA時就將BamHⅠ酶切位點最右端的一個堿基刪除，這樣插入FLAG后的載體無法再被BamHⅠ切開，可以方便地挑出陽性克隆。構建好的質粒轉染HaLa細胞后，用抗FLAG抗體能夠檢測到FLAG－BTG2融合蛋白的表達。圖6中除了FLAG－BTG2條帶外，在其下方隱約可見另一模糊條帶，本文作者認為這是由非特異性反應造成的，是因為在轉染空載體的細胞中（第1泳道）也有該條帶，而細胞內源性蛋白中并沒有FLAG表位。本研究利用標簽插入技術成功構建了pcDNA3.1 （＋）－FLAG－BTG2真核表達載體，在轉染HeLa細胞后能夠有效表達FLAGBTG2融合蛋白，為更深入地研究BTG2蛋白的功能提供了實驗平臺。

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