• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    瘦素調(diào)節(jié)HaCaT細(xì)胞角蛋白17的表達(dá)

    2014-11-28 22:32:00張敏苗葉薛柯李承新
    中華皮膚科雜志 2014年6期
    關(guān)鍵詞:角蛋白瘦素印跡

    張敏 苗葉 薛柯 李承新

    瘦素調(diào)節(jié)HaCaT細(xì)胞角蛋白17的表達(dá)

    張敏 苗葉 薛柯 李承新

    目的探討瘦素對HaCaT細(xì)胞角蛋白17(K17)表達(dá)的影響。方法體外培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞,給予100 ng/ml的瘦素作用24 h,應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR檢測K17 mRNA表達(dá)水平、Western印跡及免疫熒光染色法檢測K17蛋白表達(dá)水平變化。結(jié)果與陰性對照組(1.000 0±0.000 0)相比較,瘦素組(3.086 7±0.186 1)K17 mRNA表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Western印跡結(jié)果表明,瘦素組K17蛋白較陰性對照組顯著上調(diào),細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果與RT-PCR、Western印跡結(jié)果相符。與單純使用瘦素組(2.242 7±0.188 7)相比較,STAT3抑制劑組和Erk1/2抑制劑組K17 mRNA分別為0.674 1±0.060 0、0.855 0±0.390 3,Western印跡和細(xì)胞免疫熒光染色顯示,兩個(gè)抑制劑組的K17蛋白較瘦素組均顯著下調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論瘦素可以誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞表達(dá)K17,其機(jī)制可能與激活STAT3、Erk1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。

    HaCaT細(xì)胞;瘦素;角蛋白17

    作者單位:710032西安,第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院

    瘦素(leptin)由肥胖基因編碼的非糖基化蛋白類激素,相對分子質(zhì)量為16 000,主要由白色脂肪分泌,瘦素受體表達(dá)于卵巢、骨骼肌、胃、腦垂體及肝臟等多種組織部位,瘦素與受體結(jié)合后在抑制食欲、能量代謝、神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫功能中發(fā)揮生理功能[1]。近年來有報(bào)道,對肥胖治療后有助于銀屑病好轉(zhuǎn),提示肥胖與銀屑病相關(guān),而瘦素是參與機(jī)體代謝的脂肪因子[2]。我們前期研究發(fā)現(xiàn),瘦素對角質(zhì)形成細(xì)胞活性及細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖會(huì)產(chǎn)生影響,并能刺激角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子IL-6,IL-8,TNF-α,免疫組化檢測正常人與銀屑病患者皮損組織瘦素水平,瘦素在銀屑病患者皮損中過度表達(dá),提示瘦素可能參與銀屑病表皮過度增生增殖,但瘦素在銀屑病病理生理過程中的作用尚不明確[3]。角蛋白17作為銀屑病相關(guān)性細(xì)胞角蛋白在正常皮膚中不表達(dá),而在銀屑病患者皮損區(qū)則特異性高表達(dá)[4],其表達(dá)水平與銀屑病過程和嚴(yán)重程度有一定相關(guān)[5-6]。本研究探討瘦素是否對HaCaT細(xì)胞角蛋白17表達(dá)有調(diào)控作用。

    材料與方法

    一、材料

    HaCaT細(xì)胞株購于美國ATCC公司(本科常規(guī)保存),重組人瘦素購于美國Peprotech公司(300-27),DMEM/F12培養(yǎng)液購于美國Hyclone公司,總RNA提取試劑盒、SuperScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本TaKaRa公司,兔抗人K17單克隆抗體購于美國Epitomics公司,兔抗人β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體購于美國Sigma公司,BCA試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)公司,HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體、Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG購于康為世紀(jì)生物科技公司,STAT3通路抑制劑Piceatannol、Erk1/2抑制劑PD-98059購于瑞士Enzo公司。

    二、方法

    1.細(xì)胞培養(yǎng)與處理:HaCaT細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,分別接種于75 cm2或175 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶,置于37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng),貼壁生長后,換無血清DMEM/F12培養(yǎng)基,饑餓培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步化后,加入100 ng/ml瘦素的DMEM/F12培養(yǎng)基作用HaCaT細(xì)胞,以不加瘦素處理為陰性對照組。HaCaT細(xì)胞經(jīng)上述處理24 h后檢測K17 mRNA及蛋白表達(dá)水平。

    2.實(shí)時(shí)PCR檢測K17 mRNA表達(dá):用Trizol試劑提取培養(yǎng)的2組HaCaT細(xì)胞的總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn)錄,并以此為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性30 s,95℃5 s,60℃30 s,72℃45 s,循環(huán)次數(shù)40次,最后73℃延伸5min,以β肌動(dòng)蛋白作內(nèi)參照。K17上游引物:5'-ATGGATCCATGACCATGCAGGCCTTGGAGA-3',K17下游引物:5'-AGGAATTCTCACGTCTTCACATC CAGCAGGA-3',β肌動(dòng)蛋白上游引物:5'-CACGAT GGAGGGGCCGGACTCATC-3',β肌動(dòng)蛋白下游引物:5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3'。

    3.Western印跡檢測K17蛋白表達(dá):收集2組細(xì)胞,提取蛋白并用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量后,進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(5%濃縮膠,10%分離膠)。PVDF膜經(jīng)甲醇激活后,選用半干轉(zhuǎn)膜法,經(jīng)固定轉(zhuǎn)膜電壓20 V轉(zhuǎn)膜22min。轉(zhuǎn)膜后,室溫條件下,用TBST稀釋的5%脫脂奶粉封閉2 h,單克隆兔抗人K17抗體(1∶2 000)孵育于4℃過夜,HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(1∶2 000)37℃孵箱孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光法,經(jīng)膠片顯影檢測結(jié)果。

    4.免疫熒光染色法檢測K17蛋白表達(dá):HaCaT細(xì)胞以1.0×103密度進(jìn)行細(xì)胞爬片,按上述方法處理后培養(yǎng)24 h;使用4℃冷丙酮固定,再用0.5%的TritonX-100室溫破膜處理10min;PBS漂洗后,加入兔抗人K17單克隆抗體(1∶1 000)置于4℃濕盒過夜;Cy3標(biāo)記羊抗兔IgG熒光抗體(1∶100)避光置于37℃孵箱1 h;DAPI細(xì)胞核染料(1∶1 000)室溫孵育10min;95%緩沖甘油封片;激光共聚焦顯微鏡觀察熒光染色結(jié)果。

    5.STAT3抑制劑及ERK1/2抑制劑對瘦素表達(dá)K17的影響:細(xì)胞處理同1,饑餓培養(yǎng)24 h后,分別加入含100 ng/ml瘦素、Piceatannol+100 ng/ml瘦素、PD-98059+100 ng/ml瘦素的DMEM/F12培養(yǎng)基,分別在培養(yǎng)24 h后用實(shí)時(shí)PCR、Western印跡、免疫熒光染色法檢測K17 mRNA及蛋白表達(dá)情況。

    6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:所有數(shù)據(jù)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,各組檢測數(shù)據(jù)均以±s表示,各組用兩樣本t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    一、瘦素對HaCaT細(xì)胞K17 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

    HaCaT細(xì)胞經(jīng)100 ng/ml瘦素處理24 h后,與陰性對照組經(jīng)PBS處理后HaCaT細(xì)胞相比,瘦素組K17 mRNA表達(dá)(3.0867±0.1861)與陰性對照組(1.0000±0.0000)相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=19.421,P<0.01),且蛋白表達(dá)量上調(diào)明顯(圖1),說明瘦素能夠誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞K17 mRNA及蛋白的表達(dá)。

    圖1 Western印跡檢測瘦素作用于HaCaT細(xì)胞誘導(dǎo)K17蛋白表達(dá)結(jié)果

    二、瘦素對HaCaT細(xì)胞表達(dá)K17免疫熒光檢測

    圖2 免疫熒光檢測瘦素作用于HaCaT細(xì)胞誘導(dǎo)K17蛋白表達(dá)(×400) K17在胞質(zhì)中表達(dá)紅色熒光,藍(lán)色熒光為DAPI復(fù)染細(xì)胞核。2a:陰性對照組;2b:瘦素組

    HaCaT細(xì)胞經(jīng)100 ng/ml瘦素處理24 h行細(xì)胞爬片,經(jīng)過免疫熒光染色,置于激光共聚焦顯微鏡下(×400)觀察熒光強(qiáng)度。紅色為胞質(zhì)中K17蛋白熒光染色,藍(lán)色為細(xì)胞核,與陰性對照組相比,瘦素處理后的HaCaT細(xì)胞胞質(zhì)中K17蛋白的紅色熒光明顯增強(qiáng)(圖2),說明瘦素可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞表達(dá)K17,與RT-PCR、Western印跡結(jié)果一致。

    三、STAT3抑制劑piceatannol和Erk1/2抑制劑PD-98059對瘦素刺激HaCaT細(xì)胞K17 mRNA表達(dá)的影響

    實(shí)時(shí)PCR檢測發(fā)現(xiàn),抑制劑與瘦素聯(lián)合處理組HaCaT的K17 mRNA表達(dá)較瘦素組顯著下降,說明STAT3抑制劑Piceatannol和 Erk1/2抑制劑 PD-98059可明顯下調(diào)瘦素所誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞K17 mRNA的表達(dá)(表1)。

    表1 STAT3抑制劑Piceatannol和Erk1/2抑制劑PD-98059對瘦素刺激HaCaT K17 mRNA表達(dá)結(jié)果

    四、STAT3抑制劑Piceatannol和Erk1/2抑制劑PD-98059對瘦素刺激HaCaT細(xì)胞 K17蛋白表達(dá)的影響

    Western印跡檢測發(fā)現(xiàn),抑制劑與瘦素聯(lián)合處理組HaCaT細(xì)胞的K17蛋白表達(dá)較瘦素組顯著下降,說明STAT3抑制劑Piceatannol和Erk1/2抑制劑PD-98059可明顯下調(diào)瘦素所誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞K17蛋白的表達(dá)(圖3)。

    圖3 Western印跡檢測STAT3和ERK1/2通路抑制劑下調(diào)K17蛋白表達(dá)結(jié)果 1:陰性對照組;2:瘦素組;3:Piceatannol+瘦素組;4:PD-98059+瘦素組

    五、STAT3抑制劑Piceatannol和Erk1/2抑制劑PD-98059對瘦素刺激HaCaT細(xì)胞 K17蛋白細(xì)胞免疫熒光的影響

    細(xì)胞免疫熒光染色顯示,STAT3通路抑制劑Piceatannol和ERK1/2通路抑制劑PD-98059處理組的K17蛋白的表達(dá)較瘦素組顯著下降,說明STAT3和ERK1/2通路抑制劑能夠下調(diào)瘦素所誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞表達(dá)K17蛋白,與實(shí)時(shí)PCR、Western印跡結(jié)果一致(圖4)。

    圖4 免疫熒光檢測通路抑制劑對瘦素作用于HaCaT細(xì)胞誘導(dǎo)K17蛋白表達(dá)(×400) 陰性對照組K17表達(dá)較弱,瘦素處理細(xì)胞后K17表達(dá)明顯增強(qiáng),蛋白表達(dá)顯著高于陰性對照組。STAT3和ERK1/2通路抑制劑分別預(yù)處理細(xì)胞后加用瘦素刺激,可見K17紅色熒光強(qiáng)度減弱。4a:陰性對照組;4b:瘦素組;4c:Piceatannol+瘦素組;4d:PD-98059+瘦素組

    討 論

    Chen等[7]研究了77例銀屑病患者,與對照組進(jìn)行年齡和性別匹配,發(fā)現(xiàn)銀屑病組的瘦素高于對照組4.57倍。我們前期統(tǒng)計(jì)99例尋常型銀屑病患者臨床特征發(fā)現(xiàn),超重和肥胖人群罹患銀屑病的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高,瘦素水平與BMI指數(shù)、PASI評分都呈正相關(guān),100 ng/ml瘦素作為最佳作用濃度,可調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和趨化因子,提示瘦素可能通過調(diào)控淋巴細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞生物功能參與肥胖銀屑病發(fā)展[3]。有研究顯示,肥胖是罹患銀屑病的高風(fēng)險(xiǎn)因素,瘦素與銀屑病的病情嚴(yán)重程度存在緊密聯(lián)系,提示瘦素可能參與肥胖個(gè)體銀屑病的發(fā)生及發(fā)展[8-9]。

    本研究顯示,瘦素可以誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞高表達(dá)K17。K17被視為銀屑病自身靶抗原,與鏈球菌M6蛋白有著相同的ALEEAN氨基酸序列[10],還含有多個(gè)銀屑病特異性T細(xì)胞表位,因此能夠通過類似于M6蛋白的作用方式活化T細(xì)胞,刺激T細(xì)胞增殖并促進(jìn)其釋放相應(yīng)的細(xì)胞因子,引起一系列的應(yīng)答反應(yīng)參與銀屑病免疫紊亂的維持[11-12]。我們推測瘦素可能通過上調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞角蛋白K17表達(dá),與T細(xì)胞結(jié)合后,增加T細(xì)胞的活性狀態(tài),參與T細(xì)胞及其活化后分泌的細(xì)胞因子影響表皮增生及凋亡調(diào)控基因的表達(dá)影響KC的增生,形成一個(gè)惡性循環(huán)。有研究證實(shí),瘦素可以通過STAT3通路促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖,從而導(dǎo)致表皮增生[13]。本研究還發(fā)現(xiàn),瘦素可經(jīng)STAT3抑制劑和Erk1/2抑制劑與瘦素聯(lián)合作用后,明顯抑制K17表達(dá)。Miyoshi研究發(fā)現(xiàn)該通路在銀屑病皮損區(qū)域也有異常的表達(dá),應(yīng)用小分子STA-21抑制STAT3的核轉(zhuǎn)位后,可明顯改善銀屑病皮損,說明STAT3可作為銀屑病治療的靶點(diǎn)[14]。

    [1]Lam QL,Lu L.Role of leptin in immunity[J].Cell Mol Immunol,2007,4(1):1-13.

    [2]Davidovici BB,Sattar N,Prinz J,et al.Psoriasis and systemic inflammatory diseases:potential mechanistic links between skin disease and co-morbid conditions[J].J Invest Dermatol,2010,130(7):1785-1796.

    [3]Xue K,Liu H,Jian Q,et al.Leptin induces secretion of proinflammatory cytokines by human keratinocytesin vitro--a possible reason for increased severity of psoriasis in patients with a high body mass index[J].Exp Dermatol,2013,22(6):406-410.

    [4]Leigh IM,Navsaria H,Purkis P E,et al.Keratins(K16 and K17)as markers of keratinocyte hyperproliferation in psoriasisin vivoandin vitro[J].Br J Dermatol,1995,133(4):501-511.

    [5]王剛,劉玉峰.治療銀屑病的一個(gè)新的藥物作用靶標(biāo)-角蛋白[J].中國皮膚性病學(xué)雜志,2005,19(12):753-754.

    [6]張巍,史曉蔚,呼蕾,等.白介素調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)角蛋白的研究[J].臨床皮膚科雜志,2011,40(4):199-202.

    [7]Chen YJ,Wu CY,Shen JL,et al.Psoriasis independentlyassociated with hyperleptinemia contributing to metabolic syndrome[J].Arch Dermatol,2008,144(12):1571-1575.

    [8]Wang Y,Chen J,Zhao Y,et al.Psoriasis is associated with increased levels of serum leptin[J].Br J Dermatol,2008,158(5):1134-1135.

    [9]Cerman AA,Bozkurt S,Sav A,et al.Serum leptin levels,skin leptin and leptin receptor expression in psoriasis[J].Br J Dermatol,2008,159(4):820-826.

    [10]Gudmundsdottir A S,Sigmundsdottir H,Sigurgeirsson B,et al.Is an epitope on keratin 17 a major target for autoreactive T lymphocytes in psoriasis?[J].Clin Exp Immunol,1999,117(3):580-586.

    [11]Valdimarsson H,Sigmundsdóttir H,Jónsdóttir I.Is psoriasis induced by streptococcal superantigens and maintained by M-proteinspecific T cells that cross-react with keratin?[J].Clin Exp Immunol,1997,107 Suppl 1:21-24.

    [12]Sigmundsdottir H,Sigurgeirsson B,Troye-Blomberg M,et al.Circulating T cells of patients with active psoriasis respond to streptococcal M-peptides sharing sequences with human epidermal keratins[J].Scand J Immunol,1997,45(6):688-697.

    [13]Goren I,Pfeilschifter J,Frank S.Determination of leptin signaling pathways in human and murine keratinocytes[J].Biochem Biophys Res Commun,2003,303(4):1080-1085.

    [14]Miyoshi K,Takaishi M,Nakajima K,et al.Stat3 as a therapeutic target for the treatment of psoriasis:a clinical feasibility study with STA-21,a Stat3 inhibitor[J].J Invest Dermatol,2011,131(1):108-117.

    2013-10-14)

    (本文編輯:吳曉初)

    Leptin regulates keratin 17 expression in HaCaT human keratinocytes

    Zhang Min,Miao Ye,Xue Ke,Li Chengxin.Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China

    Li Chengxin,Email:chengxinderm@163.com

    ObjectiveTo evaluate the effect of leptin on K17 expression in HaCaT human keratinocytes.MethodsSome cultured HaCaT cells were treated with leptin(100 ng/ml)or remained untreated for 24 hours followed by the quantification of K17 mRNA expression by real-time PCR and detection of K17 protein expression by Western blot and immunofluorescence staining.To investigate the action mechanism of leptin,some cultured HaCaT cells were divided into several groups to be treated with leptin(100 ng/ml)alone,Piceatannol(an inhibitor of the STAT3 pathway)+leptin(100 ng/ml),PD-98059(an inhibitor of the Erk1/2 pathway)+leptin(100 ng/ml),respectively for 24 hours,with the cells receiving no treatment as the negative control.Subsequently,the mRNA and protein expressions of K17 were measured by the above methods.Statistical analysis was done by the two-samplettest.ResultsThe mRNA expression of K17 was significantly higher in HaCaT cells treated with leptin alone than in those remaining untreated(3.086 7±0.186 1 vs.1.000 0±0.000 0,P<0.01),but significantly downregulated in HaCaT cells treated with Piceatannol+leptin and those with PD-98059+leptin compared with those treated leptin alone(0.674 1±0.060 0 and 0.855 0±0.390 3 vs.2.242 7±0.188 7,bothP<0.01).The results of Western blot and immunofluorescence staining were in agreement with those of real-time PCR.ConclusionsLeptin can induce K17 expression in HaCaT cells,likely by activating the STAT3 and Erk1/2 signaling pathways.

    HaCaT cells;Leptin;Keratin-17

    10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.06.007

    李承新,Email:chengxinderm@163.com

    猜你喜歡
    角蛋白瘦素印跡
    馬 浩
    陶瓷研究(2022年3期)2022-08-19 07:15:18
    走進(jìn)大美滇西·探尋紅色印跡
    瘦素及瘦素受體基因多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈慢血流現(xiàn)象的相關(guān)性
    重組角蛋白單體外源表達(dá)、純化及鑒定
    成長印跡
    兔毛角蛋白的制備及其在防曬化妝品中的應(yīng)用
    哮喘患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞瘦素及Foxp3的表達(dá)
    角蛋白材料在生物領(lǐng)域中的應(yīng)用
    大科技(2016年29期)2016-07-14 08:52:43
    瘦素與血栓栓塞性疾病的相關(guān)性研究進(jìn)展
    瘦素對乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其作用機(jī)制
    亚洲精品乱久久久久久| 久久久久久久久久久久大奶| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 欧美激情久久久久久爽电影 | 日韩大片免费观看网站| 色综合欧美亚洲国产小说| 香蕉国产在线看| 91大片在线观看| 脱女人内裤的视频| 亚洲第一av免费看| 女性被躁到高潮视频| 制服诱惑二区| 国产在线免费精品| 日韩欧美国产一区二区入口| 免费在线观看日本一区| 美女大奶头黄色视频| 大香蕉久久网| 亚洲av美国av| av在线老鸭窝| 日韩一区二区三区影片| 久久久久网色| 欧美人与性动交α欧美软件| netflix在线观看网站| 国产精品亚洲av一区麻豆| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 欧美另类一区| 一级a爱视频在线免费观看| 在线观看一区二区三区激情| 高清黄色对白视频在线免费看| 最新在线观看一区二区三区| av电影中文网址| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 女性生殖器流出的白浆| 国产成人免费观看mmmm| 岛国在线观看网站| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久久水蜜桃国产精品网| 久久热在线av| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 99精品欧美一区二区三区四区| 国产在线观看jvid| 国产深夜福利视频在线观看| 99热全是精品| 黄色 视频免费看| 国产成人欧美| 激情视频va一区二区三区| 天堂俺去俺来也www色官网| 妹子高潮喷水视频| 无遮挡黄片免费观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲 国产 在线| 女人久久www免费人成看片| 日韩有码中文字幕| 国产成人精品久久二区二区免费| 午夜福利视频在线观看免费| 永久免费av网站大全| 老司机午夜福利在线观看视频 | 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲第一av免费看| 十八禁人妻一区二区| 正在播放国产对白刺激| 老司机靠b影院| 欧美黑人欧美精品刺激| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 精品少妇内射三级| 丝袜喷水一区| 电影成人av| 国产精品 欧美亚洲| 国产精品1区2区在线观看. | 亚洲精品第二区| 国产精品国产av在线观看| 国产黄色免费在线视频| 窝窝影院91人妻| 久久久久久久大尺度免费视频| 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产成人欧美在线观看 | 99久久综合免费| 99久久人妻综合| 最近中文字幕2019免费版| av片东京热男人的天堂| a级毛片黄视频| av视频免费观看在线观看| 一级,二级,三级黄色视频| 久久ye,这里只有精品| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲视频免费观看视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 精品久久久精品久久久| 青春草视频在线免费观看| 最近最新免费中文字幕在线| 精品少妇久久久久久888优播| 成人av一区二区三区在线看 | 欧美 亚洲 国产 日韩一| 精品一区二区三卡| 电影成人av| 搡老乐熟女国产| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 午夜福利,免费看| 亚洲天堂av无毛| 热re99久久国产66热| 精品人妻一区二区三区麻豆| 男女下面插进去视频免费观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 国产三级黄色录像| 亚洲七黄色美女视频| 欧美中文综合在线视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 最近中文字幕2019免费版| 久久久久视频综合| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲国产精品999| 美女主播在线视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| h视频一区二区三区| 亚洲精品自拍成人| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 久久人妻福利社区极品人妻图片| 伦理电影免费视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲天堂av无毛| 精品国产国语对白av| 国产成人系列免费观看| 国产精品成人在线| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产av一区二区精品久久| 免费人妻精品一区二区三区视频| 黄色毛片三级朝国网站| 国产xxxxx性猛交| 麻豆av在线久日| 高潮久久久久久久久久久不卡| 男人舔女人的私密视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲精品一区蜜桃| 免费看十八禁软件| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 国产淫语在线视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 搡老熟女国产l中国老女人| 欧美在线黄色| 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美国产精品va在线观看不卡| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产国语露脸激情在线看| 在线观看舔阴道视频| 国产淫语在线视频| 一区二区av电影网| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 黑丝袜美女国产一区| 国产男女内射视频| 好男人电影高清在线观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 午夜激情久久久久久久| 亚洲国产欧美日韩在线播放| av网站免费在线观看视频| 9色porny在线观看| 搡老岳熟女国产| 亚洲精华国产精华精| 日本av手机在线免费观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 桃红色精品国产亚洲av| av不卡在线播放| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产成人欧美在线观看 | 曰老女人黄片| 久久久国产精品麻豆| 婷婷丁香在线五月| 国产高清视频在线播放一区 | 韩国高清视频一区二区三区| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 久久久久久久精品精品| avwww免费| 亚洲美女黄色视频免费看| 搡老熟女国产l中国老女人| 久久久欧美国产精品| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 99国产精品一区二区三区| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 午夜福利乱码中文字幕| 99久久国产精品久久久| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲七黄色美女视频| 久久综合国产亚洲精品| 精品亚洲成a人片在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲av成人一区二区三| 久久av网站| 两人在一起打扑克的视频| 一二三四在线观看免费中文在| 国产一区二区三区综合在线观看| 欧美中文综合在线视频| 丁香六月天网| 国产熟女午夜一区二区三区| 少妇 在线观看| 女人久久www免费人成看片| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 悠悠久久av| 日本a在线网址| 精品一区二区三区av网在线观看 | 欧美激情 高清一区二区三区| 99久久精品国产亚洲精品| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 久久精品人人爽人人爽视色| 欧美久久黑人一区二区| 男女无遮挡免费网站观看| 69精品国产乱码久久久| 亚洲精品第二区| 日韩视频一区二区在线观看| 我的亚洲天堂| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 中文字幕人妻丝袜制服| 日本av手机在线免费观看| 午夜影院在线不卡| 国产麻豆69| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲性夜色夜夜综合| 91大片在线观看| 一个人免费看片子| 精品国产一区二区久久| 蜜桃国产av成人99| 午夜福利在线观看吧| 午夜日韩欧美国产| 国产又色又爽无遮挡免| 成人三级做爰电影| 精品亚洲成a人片在线观看| 久久性视频一级片| 久久久久国产精品人妻一区二区| 中文字幕人妻丝袜制服| 午夜日韩欧美国产| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 午夜久久久在线观看| 男人舔女人的私密视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 秋霞在线观看毛片| 精品免费久久久久久久清纯 | 91大片在线观看| 波多野结衣av一区二区av| 国产欧美日韩一区二区精品| 麻豆乱淫一区二区| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产免费视频播放在线视频| 1024香蕉在线观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 性少妇av在线| 18禁观看日本| 国产欧美日韩一区二区精品| 97精品久久久久久久久久精品| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 天天添夜夜摸| 丁香六月欧美| 男女床上黄色一级片免费看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 新久久久久国产一级毛片| 成人黄色视频免费在线看| 欧美日韩av久久| 久久国产精品大桥未久av| 精品一区二区三区av网在线观看 | 成年人免费黄色播放视频| 多毛熟女@视频| 新久久久久国产一级毛片| 男人操女人黄网站| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲av国产av综合av卡| av免费在线观看网站| 国产av精品麻豆| 国产成人av激情在线播放| 日韩电影二区| 夜夜夜夜夜久久久久| 少妇粗大呻吟视频| 大香蕉久久成人网| 国产精品1区2区在线观看. | 他把我摸到了高潮在线观看 | 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲色图综合在线观看| 高清视频免费观看一区二区| 国产高清videossex| 免费黄频网站在线观看国产| 三级毛片av免费| 国产精品久久久久久精品古装| 永久免费av网站大全| 久久精品国产综合久久久| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 午夜激情久久久久久久| 在线观看一区二区三区激情| 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲精品国产av蜜桃| 一区二区三区精品91| 久久久久网色| 国产福利在线免费观看视频| 超碰成人久久| 国产亚洲精品久久久久5区| 日日摸夜夜添夜夜添小说| kizo精华| 国产精品一区二区在线不卡| 午夜免费观看性视频| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 精品人妻一区二区三区麻豆| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 99精品久久久久人妻精品| 麻豆乱淫一区二区| 欧美日韩成人在线一区二区| 又紧又爽又黄一区二区| 麻豆av在线久日| 亚洲一区中文字幕在线| 90打野战视频偷拍视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 少妇精品久久久久久久| 久久这里只有精品19| 欧美国产精品va在线观看不卡| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 久久午夜综合久久蜜桃| a级片在线免费高清观看视频| 国产男女内射视频| 国产主播在线观看一区二区| 国产精品 欧美亚洲| 日韩视频在线欧美| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲成人免费av在线播放| 午夜老司机福利片| 99国产极品粉嫩在线观看| 成人黄色视频免费在线看| 一区二区三区激情视频| 男女边摸边吃奶| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 免费日韩欧美在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久久久网色| a级毛片在线看网站| 曰老女人黄片| 麻豆av在线久日| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲一码二码三码区别大吗| 久久久久久久国产电影| 国产一区二区三区av在线| 天堂俺去俺来也www色官网| 这个男人来自地球电影免费观看| 欧美成人午夜精品| 国产精品偷伦视频观看了| 一级a爱视频在线免费观看| 欧美精品一区二区大全| 少妇 在线观看| 午夜福利在线观看吧| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 国产在视频线精品| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 欧美人与性动交α欧美软件| 高清黄色对白视频在线免费看| 热99国产精品久久久久久7| 性色av乱码一区二区三区2| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 麻豆av在线久日| 国产精品99久久99久久久不卡| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 久久午夜综合久久蜜桃| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 啦啦啦在线免费观看视频4| 十八禁网站网址无遮挡| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 热99re8久久精品国产| 嫩草影视91久久| 热99re8久久精品国产| 好男人电影高清在线观看| 三级毛片av免费| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲国产av影院在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 一区二区av电影网| 一个人免费看片子| 亚洲精品国产一区二区精华液| 精品视频人人做人人爽| 国产人伦9x9x在线观看| 高清视频免费观看一区二区| 丁香六月欧美| 久久中文字幕一级| 欧美激情久久久久久爽电影 | 国产高清国产精品国产三级| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 啦啦啦 在线观看视频| xxxhd国产人妻xxx| 久久久国产精品麻豆| 9191精品国产免费久久| 久久精品国产亚洲av高清一级| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲一区二区三区欧美精品| 热re99久久精品国产66热6| tocl精华| 国产精品影院久久| 欧美黄色淫秽网站| 国产日韩欧美在线精品| 欧美国产精品一级二级三级| 国产精品二区激情视频| 国产成人免费无遮挡视频| videosex国产| 我要看黄色一级片免费的| 国产有黄有色有爽视频| 9热在线视频观看99| 男女边摸边吃奶| 韩国高清视频一区二区三区| 日韩有码中文字幕| 免费黄频网站在线观看国产| 多毛熟女@视频| 精品乱码久久久久久99久播| 国产1区2区3区精品| 免费高清在线观看日韩| 亚洲一区中文字幕在线| 大香蕉久久成人网| 久久人人97超碰香蕉20202| e午夜精品久久久久久久| 国产在线观看jvid| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 午夜福利,免费看| 国精品久久久久久国模美| 亚洲人成77777在线视频| av电影中文网址| 99国产精品一区二区蜜桃av | 久久久久网色| 黄片大片在线免费观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 日韩中文字幕视频在线看片| 久久久精品免费免费高清| 亚洲国产精品一区三区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 精品久久久精品久久久| 一级片免费观看大全| 丰满饥渴人妻一区二区三| 最黄视频免费看| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲黑人精品在线| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 一区二区三区精品91| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| av片东京热男人的天堂| 久久亚洲精品不卡| 久久国产精品人妻蜜桃| 91成年电影在线观看| 日韩免费高清中文字幕av| 满18在线观看网站| 久久久精品区二区三区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产亚洲精品第一综合不卡| 欧美国产精品一级二级三级| 国产在线视频一区二区| 无限看片的www在线观看| 久久久久久久久久久久大奶| 老汉色∧v一级毛片| 午夜老司机福利片| 日韩精品免费视频一区二区三区| 人人澡人人妻人| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 一本久久精品| 亚洲精华国产精华精| 蜜桃国产av成人99| 国产区一区二久久| 久久久欧美国产精品| 国产av国产精品国产| 国产av精品麻豆| 老司机在亚洲福利影院| 波多野结衣一区麻豆| 99国产极品粉嫩在线观看| 午夜激情久久久久久久| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲av成人一区二区三| 老鸭窝网址在线观看| 欧美日韩黄片免| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 精品视频人人做人人爽| 精品少妇久久久久久888优播| 成在线人永久免费视频| 国产精品1区2区在线观看. | 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 最新的欧美精品一区二区| 纯流量卡能插随身wifi吗| 狂野欧美激情性xxxx| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产免费视频播放在线视频| 99国产精品一区二区蜜桃av | 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产激情久久老熟女| www.999成人在线观看| 91九色精品人成在线观看| 老鸭窝网址在线观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 日韩中文字幕视频在线看片| 久久天堂一区二区三区四区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产欧美日韩一区二区三 | 精品一品国产午夜福利视频| 多毛熟女@视频| 人妻 亚洲 视频| av国产精品久久久久影院| 欧美xxⅹ黑人| 国产成人欧美| 亚洲综合色网址| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲专区字幕在线| 91国产中文字幕| 精品人妻1区二区| 亚洲欧洲日产国产| videosex国产| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产国语露脸激情在线看| av欧美777| 中文字幕av电影在线播放| 国产福利在线免费观看视频| 飞空精品影院首页| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲精品国产精品久久久不卡| www日本在线高清视频| 两性夫妻黄色片| 一个人免费看片子| 我的亚洲天堂| 男女免费视频国产| 午夜视频精品福利| 欧美另类亚洲清纯唯美| 大香蕉久久网| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 不卡一级毛片| 久久久久视频综合| 老汉色av国产亚洲站长工具| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产精品国产av在线观看| 精品少妇内射三级| 18在线观看网站| 国产野战对白在线观看| 久久影院123| 俄罗斯特黄特色一大片| 韩国高清视频一区二区三区| 各种免费的搞黄视频| 在线精品无人区一区二区三| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲熟女精品中文字幕| 久久狼人影院| 男男h啪啪无遮挡| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 久久精品人人爽人人爽视色| 亚洲专区国产一区二区| 免费不卡黄色视频| 精品乱码久久久久久99久播| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 一本综合久久免费| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲欧美色中文字幕在线| 精品国内亚洲2022精品成人 | 少妇精品久久久久久久| 一级毛片女人18水好多| cao死你这个sao货| 999久久久国产精品视频| 久久久精品94久久精品| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲精品国产区一区二| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 成人免费观看视频高清| 一边摸一边做爽爽视频免费| 成人国产av品久久久| 精品福利永久在线观看| 久久人人97超碰香蕉20202| 正在播放国产对白刺激| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 大香蕉久久成人网| 国产日韩欧美在线精品| 91精品国产国语对白视频| 午夜福利在线观看吧| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 黄色怎么调成土黄色| 伊人亚洲综合成人网| av天堂在线播放| 精品一区二区三区av网在线观看 | 波多野结衣一区麻豆| 精品一品国产午夜福利视频| 9191精品国产免费久久| 日本av免费视频播放| 精品一品国产午夜福利视频| 久久精品国产综合久久久| 香蕉国产在线看| 欧美黑人精品巨大| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 男人操女人黄网站| 国产av一区二区精品久久| 美国免费a级毛片| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 日韩欧美一区视频在线观看| 精品久久久精品久久久| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 热re99久久国产66热| 国产黄频视频在线观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产成人免费无遮挡视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产xxxxx性猛交| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产一区二区三区av在线| 人妻 亚洲 视频| 中文字幕精品免费在线观看视频| 99热国产这里只有精品6| 黄片小视频在线播放|