HO- 1減輕吸煙大鼠血清引起的HUVEC氧化損傷

楊根歡，吳 為，李硯川，倪 冷，王占啟，王超楠，劉昌偉*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 1.北京協(xié)和醫(yī)院 血管外科, 北京 100730；2.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100005)

研究論文

HO- 1減輕吸煙大鼠血清引起的HUVEC氧化損傷

楊根歡1，吳 為2，李硯川2，倪 冷1，王占啟1，王超楠1，劉昌偉1*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 1.北京協(xié)和醫(yī)院 血管外科, 北京 100730；2.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100005)

目的探討血紅素氧化酶- 1(HO- 1)是否能夠減輕吸煙大鼠血清引起的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的氧化損傷。方法15只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組、吸煙組、吸煙并注射鋅原卟啉(ZnPP)組。建立大鼠吸煙模型。Western blot檢測各組大鼠頸動(dòng)脈中HO- 1的表達(dá)。體外培養(yǎng)HUVEC，分為加入正常大鼠血清、吸煙大鼠血清和吸煙并注射ZnPP大鼠血清。Western blot檢測各組HO- 1的表達(dá)。將吸煙大鼠血清加入HO- 1過表達(dá)及HO- 1低表達(dá)的HUVEC中，應(yīng)用二氫溴化乙啶檢測各組活性氧的含量。結(jié)果吸煙可以明顯誘導(dǎo)大鼠頸動(dòng)脈中HO- 1的表達(dá)(Plt;0.01)。吸煙大鼠血清及吸煙并注射ZnPP大鼠血清均可誘導(dǎo)HUVEC中HO- 1的表達(dá)，但后者作用更強(qiáng)(Plt;0.01)。吸煙大鼠血清能使HUVEC內(nèi)活性氧含量增多(Plt;0.01)，HO- 1能減輕此氧化損傷(Plt;0.01)。結(jié)論吸煙大鼠血清可以造成HUVEC的氧化損傷，H0- 1能夠減輕此氧化損傷作用。

吸煙； 血紅素氧化酶- 1；內(nèi)皮細(xì)胞； 氧化損傷

吸煙是動(dòng)脈粥樣硬化最主要的危險(xiǎn)因素之一。它可以引起組織及細(xì)胞的氧化損傷，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常功能[1]。血紅素氧化酶- 1(HO- 1)是血紅素在體內(nèi)代謝的限速酶，是體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)。HO- 1是誘導(dǎo)型的血紅素氧化酶，細(xì)胞在缺氧、氧化應(yīng)激、重金屬和內(nèi)毒素等刺激下其表達(dá)會(huì)增高[2]。已有研究表明HO- 1對血管內(nèi)皮細(xì)胞起重要的保護(hù)作用[3]。本研究闡明了吸煙血清對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷作用及HO- 1能夠減輕此氧化損傷作用。

1 材料與方法

1.1 材料

限制性核酸內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶(NEB公司)，DNA聚合酶(Transgene生物技術(shù)有限公司)，引物合成(Invitrogen公司)，F(xiàn)uGENE HD轉(zhuǎn)染試劑(Roche公司)，高糖-DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)，胎牛血清(Gibco公司), HUVEC及內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ScienCell 公司),HO- 1 siRNA(CST公司),鼠抗人Heme Oxygenase- 1抗體(BD公司)，鋅原卟啉- 9(Sigma公司)，細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧紅色熒光檢測試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)。

1.2 慢病毒載體pLenti-HO- 1的構(gòu)建和鑒定

針對HO- 1的CDS區(qū)設(shè)計(jì)引物，兩端加上酶切位點(diǎn)MluⅠ和BamHⅠ。PCR擴(kuò)增HO- 1，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳回收。引物序列：正向:5′-TAAG AATTCGCCACCATGGAGCGTCCGCAACC-3′,反向：5′-AATACGCGTCATGGCATAAAGCCCTACAGC-3′。分別對PCR產(chǎn)物和改造的病毒空載體Plentilox3.7行MluⅠ和BamHⅠ雙酶切。經(jīng)純化、連接和轉(zhuǎn)化后，將感受態(tài)大腸埃希菌涂于LB平板并孵育。PCR鑒定陽性的克隆。用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T，Western blot檢測HEK293T中HO- 1的表達(dá)。

將重組質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒(plp1、plp2和VSVG)共同轉(zhuǎn)染HEK293T，12 h后換液。24和48 h后分別收集上清并過濾，4 ℃、18 000 r/min離心3 h。棄掉上清后，用冷PBS重懸病毒并分裝凍存于-80 ℃。同時(shí)用病毒懸液感染HEK293T及HUVEC，Western blot檢測HO- 1的表達(dá)。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及吸煙大鼠血清的制備

15只SPF級(jí)雄性SD大鼠，平均體質(zhì)量350 g[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(京)20120001 ]。將動(dòng)物隨機(jī)分為吸煙組、吸煙并注射ZnPP(HO- 1抑制劑)組和正常對照組，每組5只。吸煙動(dòng)物置于自制的大鼠吸煙裝置中吸煙[4]。每天上下午各1次，每次吸煙20支(焦油量：13 mg/支，煙堿量：1.2 mg/支，CO量：14 mg/支)。每次同時(shí)點(diǎn)燃4支香煙，燃燒完后休息5 min再繼續(xù)吸煙。隔天腹腔注射ZnPP1次，15 mg/kg。吸煙7 d后，取各組頸動(dòng)脈標(biāo)本置于液氮中保存，同時(shí)經(jīng)腹主動(dòng)脈盡量采取全部血液。所取血液于4 ℃過夜。將上層析出的血清再次離心后收集上清，并將其置于60 ℃中20 min滅活補(bǔ)體后置于-20 ℃保存。

1.4 Western blot檢測HO- 1的表達(dá)

將頸動(dòng)脈標(biāo)本從液氮中取出后置于研缽中，加入200 μL SDS組織裂解液后研磨成組織勻漿。測定蛋白濃度后，傳統(tǒng)方法行Western blot。用AlphaEaseFC軟件測量條帶的吸光度值，將各組的吸光度值行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)及吸煙血清對其氧化性的檢測

將HUVEC傳至6孔板中，細(xì)胞鋪展80%時(shí)換液。分別換為正常培養(yǎng)基、10%正常大鼠血清、5%吸煙大鼠血清、10%吸煙大鼠血清、5%吸煙并注射ZnPP組大鼠血清、10%吸煙并注射ZnPP組大鼠血清。孵育18 h后，行Western blot檢測HO- 1的表達(dá)。

將HUVEC傳至12孔板中。細(xì)胞達(dá)50%匯合時(shí)分別用攜帶HO- 1的慢病毒載體感染3個(gè)孔的細(xì)胞和HO- 1 siRNA轉(zhuǎn)染3個(gè)孔的細(xì)胞。48 h后取慢病毒和siRNA干預(yù)過的細(xì)胞及正常細(xì)胞行Western blot檢測HO- 1的表達(dá)。留取3個(gè)孔加入含40%正常大鼠血清的培養(yǎng)基做對照，其余孔加入含40%吸煙大鼠血清的培養(yǎng)基。3 h后按試劑盒說明書操作檢測各組中活性氧的含量并于熒光顯微鏡下觀察。熒光的強(qiáng)弱代表細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量即細(xì)胞被氧化的程度。用Image-ProPlus 6.0軟件測量各組的熒光強(qiáng)度并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 慢病毒載體pLenti-HO- 1構(gòu)建成功

擴(kuò)增的目的基因片段大小與預(yù)期的相符。HEK293T能夠成功表達(dá)重組質(zhì)粒。慢病毒感染的HEK293T及HUVEC有綠色熒光出現(xiàn)且慢病毒感染兩種細(xì)胞的效率均較高。兩種細(xì)胞均成功表達(dá)HO- 1，表明慢病毒載體pLenti-HO- 1構(gòu)建成功且能有效感染HEK293T和HUVEC。

*Plt;0.01 compared with ZnPP+smoking; #Plt;0.01 compared with control圖1 不同處理組大鼠頸動(dòng)脈HO- 1表達(dá)情況Fig 1 The expression of HO- 1 in carotid arteriestreated differently

2.2 不同處理組大鼠頸動(dòng)脈HO- 1含量的檢測

吸煙組大鼠頸動(dòng)脈中HO- 1含量明顯高于正常對照組大鼠(Plt;0.01)和吸煙并注射ZnPP組大鼠(Plt;0.01)(圖1)。

2.3不同處理組大鼠血清對HUVEC中HO-1表達(dá)的影響

正常大鼠血清對HUVEC中HO- 1的表達(dá)無明顯影響。吸煙大鼠血清能夠明顯誘導(dǎo)HO- 1的表達(dá)(Plt;0.01)，且表達(dá)成劑量依賴性(10%組高于5%組)。吸煙并注射ZnPP組的大鼠血清也能夠明顯誘導(dǎo)HO- 1的表達(dá)(Plt;0.01)，且表達(dá)成劑量依賴性(10%組高于5%組)。同時(shí)其誘導(dǎo)HO- 1的表達(dá)明顯高于各個(gè)濃度的吸煙大鼠血清(Plt;0.05)(圖2)。

*Plt;0.01 compared with control; #Plt;0.01 compared with 10% smoking圖2 不同處理組大鼠血清對HUVEC細(xì)胞中HO- 1表達(dá)的影響Fig 2 The expression of HO- 1 in HUVEC incubatedin serum of rats treated differently

2.4吸煙大鼠血清對HUVEC的氧化作用及HO-1的抗氧化作用

慢病毒載體和siRNA能夠成功使HO- 1基因過表達(dá)和抑制(Plt;0.01)(圖3)。加入吸煙大鼠血清的正常HUVEC組細(xì)胞內(nèi)活性氧含量明顯多于加入正常大鼠血清組(Plt;0.01)及HO- 1過表達(dá)組(Plt;0.01)，HO- 1抑制組高于加入吸煙大鼠血清的正常HUVEC組(Plt;0.05)(圖4)。

*Plt;0.01 compared with control圖3 病毒感染組和siRNA轉(zhuǎn)染組HUVECs中HO- 1表達(dá)情況Fig 3 The expression of HO- 1 in virus infecting and siRNA transfecting HUVECs

A.HUVECs incubated in the serum of normal rats; B. HUVECs incubated in the serum of smoking rats; C.HUVECs(infected by virus) incubated in the serum of smoking rats; D.HUVECs(transfected by siRNA) incubated in the serum of smoking rats;*Plt;0.01 compared with A or C;#Plt;0.05 compared with B

圖4吸煙大鼠血清對HUVECs細(xì)胞的氧化作用及HO-1的保護(hù)作用
Fig4TheoxidativeroleoftheserumofsmokingratsandtheantioxidanteffectofHO-1(×100)

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)香煙的煙霧中含有的毒害物質(zhì)有4 000多種[5],包括高濃度的活性氧、NO、過(氧化)亞硝酸鹽及多種有機(jī)化合物[6- 7]。這些物質(zhì)中很多是水溶性的，可以直接進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)而可以對組織細(xì)胞造成包括氧化損傷在內(nèi)的多種損傷[8]。吸煙造成氧化損傷的機(jī)制主要包括，煙霧中的活性氧等成分可以直接對組織細(xì)胞造成氧化損傷，煙霧中某些成分可以激活細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)的酶進(jìn)而引起氧化損傷，煙霧可以引起機(jī)體的炎性反應(yīng)進(jìn)而導(dǎo)致氧化損傷[9- 10]。因此氧化損傷是吸煙造成組織損傷的主要形式之一。減輕吸煙造成的氧化損傷對于保護(hù)吸煙狀態(tài)下的血管具有重要意義。

本研究中吸煙可以明顯誘導(dǎo)大鼠頸動(dòng)脈中HO- 1的表達(dá)。這表明吸煙可以引起血管的氧化損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)抗氧化物質(zhì)HO- 1的表達(dá)。吸煙大鼠血清能夠誘導(dǎo)HUVEC中HO- 1的表達(dá)，且表達(dá)成劑量依賴性。這間接表明吸煙大鼠血清能夠造成HUVEC的氧化損傷。吸煙并注射ZnPP組大鼠血清也能夠明顯誘導(dǎo)HUVEC中HO- 1的劑量依賴性的表達(dá)，且表達(dá)量明顯高于吸煙大鼠血清。這說明抑制了吸煙大鼠體內(nèi)HO- 1的表達(dá)后，機(jī)體組織受到了更強(qiáng)的氧化損傷，其血清中能造成氧化損傷的物質(zhì)更多，能夠?qū)UVEC造成更強(qiáng)的氧化損傷。同時(shí)間接表明HO- 1能夠減輕吸煙誘導(dǎo)的氧化損傷。用DHE直接檢測加入吸煙大鼠血清的HUVEC中活性氧的含量，結(jié)果顯示HO- 1低表達(dá)組最多，其次是正常HUVEC組，HO- 1過表達(dá)組最少。這直接說明吸煙大鼠血清對HUVEC具有明顯的氧化損傷作用，HO- 1能夠減輕這種氧化損傷作用。

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Heme oxygenase- 1 alleviates the oxidative damagecaused by serum of smoking rats on human umbilical vein endothelial cells

YANG Gen-huan1,WU Wei2, LI Yan-chuan2, NI Leng1, WANG Zhan-qi1, WANG Chao-nan1, LIU Chang-wei1*

(1.Dept. of Vascular Surgery, PUMC Hospital, CAMS amp; PUMC, Beijing 100730；2.State Key Laboratory of Medical Molecular Biology, CAMS amp; PUMC,Beijing 100005,China)

ObjectiveTo study whether heme oxygenase- 1(HO- 1) may alleviate the oxidative damage caused by serum of smoking rats on human umbilical vein endothelial cell(HUVEC).MethodsFifteen male sprague-dawley rats were randomized into control group,smoking group and smoking with Zincprotoporphyrin(ZnPP) group.Western blot was used to detect the expression of HO- 1 in carotid arteries of the rats.Also the expression of HO- 1was detected in HUVEC cultured in the serum of normal rats,smoking rats and smoking with ZnPP rats.The reactive oxygen species were detected in HO- 1-overexpressing and HO- 1-lowexpressing HUVEC,cultured in the serum of smoking rats.ResultsThe expression of HO- 1 in carotid arteries of smoking rats was significantly higher than that of normal rats(Plt;0.01).Both the serum of smoking rats and HO- 1depressed smoking rats induced the expression of HO- 1 in HUVEC,and the role of the latter was more significant(Plt;0.01).The reactive oxygen species of HUVEC cultured in the serum of smoking rats were more than that cultured in the serum of nornal rats(Plt;0.01),also the HO- 1 may release the oxidative damage(Plt;0.01).ConclusionsSmoking can cause the oxidative damage to HUVEC,and HO- 1 alleviates the damage.

smoking; heme oxygenase- 1; endothelial cell; oxidative damage

2014- 04- 25

2014- 05- 27

北京市自然科學(xué)基金(7122145)

*通信作者(correspondingauthor)：liucw@vip.sina.com

1001-6325(2014)10-1358-05

Q 554

A