阿托伐他汀通過轉(zhuǎn)錄因子AP1抑制AS大鼠VSMC增殖及促凋亡

李玉媚，王 輝*，康 敏，張文宇，陳 偉，胡 楠，歐和生*

(廣西醫(yī)科大學(xué) 1.藥學(xué)院; 2.第一附屬醫(yī)院 耳鼻喉科，廣西 南寧 530021)

研究論文

阿托伐他汀通過轉(zhuǎn)錄因子AP1抑制AS大鼠VSMC增殖及促凋亡

李玉媚1，王 輝1*，康 敏2，張文宇1，陳 偉1，胡 楠1，歐和生1*

(廣西醫(yī)科大學(xué) 1.藥學(xué)院; 2.第一附屬醫(yī)院 耳鼻喉科，廣西 南寧 530021)

目的探討阿托伐他汀對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化(AS)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(VSMC)調(diào)節(jié)及轉(zhuǎn)錄因子AP1的作用。方法80只大鼠隨機(jī)分為: 普通飼料組、AS組和阿托伐他汀高低劑量組(40和10 mg/kg·d)。用原位TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡；用免疫組化檢測(cè)血管中AP1和α-SM-actin蛋白表達(dá)；用蛋白免疫印跡法檢測(cè)血管相關(guān)蛋白AP1表達(dá)。結(jié)果阿托伐他汀高和低劑量組TG、TC和LDL明顯下降(Plt; 0.05)。阿托伐他汀抑制AS大鼠VSMC增殖，促進(jìn)其促凋亡(Plt;0.05)。阿托伐他汀干預(yù)后AS大鼠VSMC中AP1和α-SM-actin蛋白表達(dá)明顯減少(Plt;0.05)。結(jié)論阿托伐他汀通過下調(diào)AP1抑制AS大鼠VSMC增殖及促凋亡。

阿托伐他汀; 血管平滑肌細(xì)胞；AP1；α-SM-actin

血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)表型改變及調(diào)控是AS最重要和關(guān)鍵因素。VSMC的正常增殖與分化是維持血管正常功能的必要條件。他汀類藥物通過改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、抑制炎性反應(yīng)、抑制VSMC增生和凋亡、減少脂質(zhì)在血管內(nèi)皮層的沉積及泡沫細(xì)胞形成、抑制血小板的活性和聚集等, 從而達(dá)到穩(wěn)定斑塊的作用[1- 2]。AP1與VSMC表型轉(zhuǎn)變及VSMC增殖、凋亡、分化和遷移的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。本研究探討阿托伐他汀對(duì)AS大鼠VSMC增殖和凋亡的影響及AP1的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

AP1單克隆抗體和α-SM-actin抗體(Santa Cruz 公司)；SABC(鼠 IgG)POD試劑盒(廣州銳博生物科技有限公司)；DAB顯色試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；ECL(Invitrogen公司)；辣根過氧化物酶結(jié)合抗體(南寧博仁生物科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠(體質(zhì)量250～300 g) 80只，雌雄各半，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：[SCXK(桂)2010- 0003]。隨機(jī)均分為：普通飼料組、動(dòng)脈硬化組和阿托伐他汀高低劑量組。

靜脈取血，用全自動(dòng)生化儀測(cè)定血脂，以各組生化指標(biāo)顯著升高為造模成功標(biāo)志。在前10周,阿托伐他汀組喂養(yǎng)同AS組，后5周分別每日加溫水灌服阿托伐他汀(10 mg/kg)、(40 mg/kg)[4]。

1.3 方法

1.3.1 血脂測(cè)定：各組動(dòng)物分別在第15周結(jié)束后，經(jīng)中央動(dòng)脈采血，將2 mL動(dòng)脈血靜置后，以酶比色測(cè)定法檢測(cè)血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL)。

1.3.2 組織形態(tài)學(xué)的檢查：分離胸主動(dòng)脈，用10%甲醛溶液固定、石蠟包埋、3～4 μm厚度切片。常規(guī)脫蠟和脫水后HE染色，觀察AS病變情況。

1.3.3 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡：石蠟切片脫蠟及水化后，經(jīng)封閉、透化后加入TUNEL 反應(yīng)液，于37 ℃孵育60 min，用DAB 法顯色。

1.3.4 免疫組化方法檢測(cè)AP1和α-SM-actin蛋白表達(dá)：石蠟切片脫蠟和水化， PBS洗3次，0.01 mol/L檸檬酸鹽液熱修復(fù)抗原90 s。接著PBS洗3次，室溫孵育15 min。PBS洗3次，非免疫血清封閉40 min，室溫下孵育10 min。除去血清，滴加Ⅰ抗AP1(1∶400)或α-SM-actin(1∶500)，37 ℃下孵育1 h。再滴加二抗體IgG(1∶300)，置于室溫20 min，PBS洗3次。滴加DAB顯色。滴加蘇木精復(fù)染2 min，鹽酸分化，PBS洗10 min。最后脫水、封片。顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)算吸光度值，取平均值。

1.3.5 Western blot檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)：提取VSMC總蛋白，取50 μg蛋白質(zhì)在8%SDS-PAGE上電泳，后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，將膜加入AP1(工作濃度1∶1 000)并在4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min．二抗(辣根過氧化物酶結(jié)合的抗體(工作濃度1∶1 000)雜交，37 ℃孵育45 min，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。將膜與化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑反應(yīng)2 min：A、B混合溶液激發(fā)熒光,在暗室X線曝光，顯影、定影后進(jìn)行圖像分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 阿托伐他汀對(duì)AS大鼠血脂的影響

與正常組比較，AS組TG、TC與LDL明顯升高(Plt;0.05)；與AS組比較，阿托伐他汀高及低劑量組TG、TC與LDL顯著下降 (Plt;0.05)。

2.2 阿托伐他汀對(duì)AS大鼠主動(dòng)脈形態(tài)的影響

普通飼料組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑完整，未見增生。平滑肌層與中層彈力膜相間排列且整齊，內(nèi)皮與內(nèi)彈性膜緊貼，內(nèi)膜不剝脫(圖1A)。AS組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜損傷、增生，中層VSMC大量增生并向內(nèi)膜遷移且紊亂，中膜彈性纖維斷裂，粥樣斑塊向外凸出并破裂 (圖1B)。阿托伐他汀高劑量組內(nèi)膜損傷明顯減輕，內(nèi)膜增生顯著減少，血管壁變薄(圖1C)。阿托伐他汀低劑量組內(nèi)膜損傷減輕，內(nèi)膜增生減少，血管壁變薄(圖1D)。

2.3 阿托伐他汀對(duì)AS大鼠VSMC凋亡的影響

與對(duì)照組比較，AS組VSMC呈棕褐色，包括核膜皺縮及胞核的崩解，表達(dá)增多(Plt;0.01)；與AS組比較，阿托伐他汀高及低劑量細(xì)胞凋亡率明顯增加(Plt;0.01)。高劑量組凋亡率比低劑量組增加更顯著(Plt;0.05) (表1，圖2)。

2.4阿托伐他汀對(duì)動(dòng)脈硬化大鼠VSMC特異性α-SM-actin蛋白的影響

4組大鼠胸主動(dòng)脈的中膜均呈陽性染色、AS組和阿托伐他汀高、低劑量組的增生內(nèi)膜及中膜呈高表達(dá)。與對(duì)照組對(duì)比,α-SM-actin在AS組表達(dá)顯著增加(Plt;0.01)；與AS對(duì)比，α-SM-actin在阿托伐他汀高及低劑量組表達(dá)明顯下降(Plt;0.01)(表1，圖3)。

A.control group；B.AS group；C.high-dose atorvastatin group；D.low-dose atorvastatin group圖1 大鼠胸主動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)改變Fig 1 Thoracic aortic morphological changes in rats(HE×200)

A.control group；B.AS group；C.high-dose atorvastatin group；D.low-dose atorvastatin group圖2 阿托伐他汀對(duì)平滑肌細(xì)胞凋亡影響Fig 2 Effect of the atorvastatin on apoptosis of VSMC(×200)

A.control group；B.AS group；C.high-dose atorvastatin group；D.low-dose atorvastatin group圖3 阿托伐他汀對(duì)α-SM-actin蛋白表達(dá)影響Fig 3 Effect of the atorvastatin on α-SM-actin protein expression(×400)

groupapoptosisindexAvaluerate(%)control 8.5±1.575.74±5.32—AS25.3±2.1*45.35±4.25*67.01high-doseatorvastatin33.5±2.4*#64.42±5.62*#42.05low-doseatorvastatin30.2±2.4*#58.34±5.43*#28.6

*Plt;0.01 compared with control；#Plt;0.05 compared with AS.

2.5 阿托伐他汀對(duì)AS VSMC AP1蛋白影響

免疫組化檢測(cè)AP1蛋白表達(dá)，AP1陽性染色呈棕黃色。與對(duì)照組對(duì)比, AP1在AS組表達(dá)顯著增加(Plt;0.05)；與AS對(duì)比，AP1在阿托伐他汀高及低劑量組表達(dá)明顯下降(Plt;0.01)(表2，圖4)。

2.6 阿托伐他汀抑制AP1蛋白表達(dá)

與對(duì)照組對(duì)比, AP1蛋白表達(dá)在AS組表達(dá)顯著增加(Plt;0.05)；與AS對(duì)比，AP1蛋白表達(dá)在阿托伐他汀高及低劑量組表達(dá)明顯下降(Plt;0.01)(表2，圖5)。

A.control group；B.AS group；C.high-dose atorvastatin group；D.low-dose atorvastatin group圖4 阿托伐他汀對(duì)AP1蛋白表達(dá)的影響Fig 4 Effect of the atorvastatin on AP1 protein expression(×400)

groupAvaluerate(%)Avaluerate(%)control 52.67±4.52— 1.32±0.06—AS 40.52±3.41*-23.07 1.70±0.03*-28.78high-doseatorvastatin 65.52±6.35**#61.70 0.45±0.02**#73.53low-doseatorvastatin 61.32±7.43**#51.33 1.02±0.05**#40.00

*Plt;0.05，**Plt;0.01 compared with control；#Plt;0.05 compared with AS.

1.control group；2.AS group；3.high-dose atorvastatin group；4.low-dose atorvastatin group圖5 阿托伐他汀對(duì)AP1蛋白表達(dá)影響Fig 5 Effect of atorvastatin on AP1 protein expression

3 討論

阿托伐他汀在AS發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[5]。本文探討阿托伐他汀對(duì)AS大鼠VSMC增殖和凋亡的影響及AP1的作用。研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀通過下調(diào)AP1抑制AS大鼠VSMC增殖及凋亡。

VSMC和內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡是AS病變主要原因，而VSMC增殖和凋亡起主導(dǎo)作用[6]。阿托伐他汀具抗氧化、調(diào)節(jié)細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)及細(xì)胞凋亡等作用[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀高及低劑量組α-SM-actin蛋白表達(dá)下降且凋亡率提高。提示阿托伐他汀促進(jìn)AS大鼠VSMC凋亡，起到延緩AS發(fā)生和發(fā)展的作用。

AP1參與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控，AP1蛋白表達(dá)水平與VSMC增殖密切相關(guān)[8]。此外，AP1與Ras有絲分裂信號(hào)共同參與VSMC生長(zhǎng)[9]。一些轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞增殖、凋亡過程中扮演重要角色，細(xì)胞增殖能力降低與一些轉(zhuǎn)錄因子：AP1, SP1,HSF-1,E2F表達(dá)水平下降有關(guān)[10]。此外，AP1(c-fos和c-jun)是G1期進(jìn)程關(guān)鍵控制點(diǎn)[11]。因此，選AP1檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀通過下調(diào)AP1抑制AS大鼠VSMC增殖及凋亡。另外，不同劑量他汀類藥物通過調(diào)脂和非調(diào)脂協(xié)同作用，可有效預(yù)防AS及血管成形術(shù)后再狹窄。高劑量組阿托伐他汀對(duì)AS大鼠VSMC抑制更加明顯。該作用機(jī)制可能是阿托伐他汀通過調(diào)節(jié)AP1表達(dá)水平而影響VSMC增殖及凋亡。但AP1參與VSMC增殖的分子作用機(jī)制尚不清楚。

綜上所述，本研究闡明阿托伐他汀與某些轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控細(xì)胞的分子機(jī)制，AP1可能介導(dǎo)阿托伐他汀在VSMC增殖或凋亡中起調(diào)控作用。本研究為研究心血管疾病靶點(diǎn)提供一種新方法，其潛在臨床應(yīng)用也具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

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Atorvastatin inhibits the proliferation andptomotes apoptosis of VSMC by the transcription factor AP1 in rats

LI Yu-mei1, WANG Hui1*, KANG Min2, ZHANG Wen-yu1, CHEN Wei1, HU Nan1, OU He-sheng1*

(1.College of Pharmacy,Guangxi Medical University;2.Dept. of Ear-nose-throat, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China)

ObjectiveTo investigate effect of atorvastatin to inhitit proliferation and to promote apoptosis of VSMC by the transcription factor AP1 in rats.MethodsEighty rats were randomly divided into four groups: normal group,AS group, high-dose atorvastatin group (40 mg/kg·d), low-dose atorvastatin group (10 mg/kg·d).The VSMC apoptosis was detected by TUNEL assay.The protein expression level of AP1 and α-SM-actin were measured by immunohistochemical analysis and Western blot.ResultsTG, TC and LDL were significantly decreased in two atorvastatin groups (Plt;0.05). Atorvastatin significantly inhibited the VSMC proliferation and induced apoptosis (Plt;0.05). Atorvastatin regulated AP1 and α-SM-actin protein expression significantly decreased(Plt;0.05).ConclusionsThe atorvastatin suppresses proliferation and promotes apoptosis of VSMC through down-regulation of AP1 expression in rats suppressing AP1 expression in VSMC.

atorvastatin; vascular smooth muscle cell;AP1；α-SM-actin

2014- 03- 20

2014- 05- 27

國家自然科學(xué)基金(81373403); 廣西碩士研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(YCSZ2013031)

*通信作者(correspondingauthor)：hsouol@yahoo.com; 465580297@qq.com

1001-6325(2014)10-1339-05

R 97

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