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    冬凌草甲素和冬凌草乙素與谷胱苷肽的邁克爾加成反應(yīng)

    2014-11-27 05:39:36劉建群高俊博舒積成
    化學(xué)研究 2014年6期
    關(guān)鍵詞:冬凌草乙素甲素

    劉建群,高俊博,舒積成,張 銳

    (江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室,江西 南昌 330004)

    邁克爾加成反應(yīng)[1]是親電的共軛體系與親核的負(fù)電體系進(jìn)行的共軛親核加成反應(yīng).一般來說,烯鍵或炔鍵與吸電子基團(tuán)共軛相連形成的官能團(tuán)可構(gòu)成親電共軛體系,含有該共軛體系的化合物稱為邁克爾反應(yīng)受體分子.邁克爾反應(yīng)受體分子具有許多重要的藥理活性,如酶抑制活性[2],抗病毒活性[3],抗炎活性[4],醌還原酶誘導(dǎo)活性[5],抗腫瘤活性[6-7]等.邁克爾反應(yīng)受體分子是一類重要的烷化劑,它能與細(xì)胞酶中半胱氨酸殘基的巰基或細(xì)胞上其他親核基團(tuán)發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)形成共價鍵結(jié)合,從而產(chǎn)生重要的生物效應(yīng)[2,7-8].冬凌草甲素和冬凌草乙素是從中藥冬凌草(Rabdosia rubescens)中分離出來的具有抗腫瘤等活性的對映貝殼杉烯二萜類成分[9],也是一類重要的天然邁克爾反應(yīng)受體分子.對映貝殼杉烯二萜具有較廣譜的抗腫瘤活性,對人早幼粒白血病細(xì)胞、人宮頸癌細(xì)胞、人食管癌細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞[7,10-11]等許多腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用.研究表明,絕大多數(shù)對映貝殼杉烯類化合物的抗腫瘤活性與其D環(huán)中具有exo-亞甲基環(huán)戊酮結(jié)構(gòu)有關(guān).該結(jié)構(gòu)可以與受體氨基酸的親核基團(tuán),如氨基、羥基及巰基等發(fā)生不可逆邁克爾加成反應(yīng),從而顯示出較好的抗腫瘤活性,此機(jī)制已得到大多數(shù)研究者的認(rèn)可[12].還原型谷胱苷肽(GSH)是一種含有游離巰基的生物活性分子,在機(jī)體細(xì)胞中含量豐富.GSH具有很好的清除氧自由基活性,從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化傷害的能力[13-14].GSH的缺乏可引起機(jī)體細(xì)胞受損凋亡,GSH水平是反映機(jī)體細(xì)胞是否健康的標(biāo)志[15-16].邁克爾反應(yīng)受體分子能與細(xì)胞酶中半胱氨酸殘基的巰基等親核基團(tuán)發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)形成共價鍵結(jié)合,從而產(chǎn)生抗腫瘤等重要的生物效應(yīng).為闡明冬凌草甲素和冬凌草乙素等対映貝殼杉烯二萜抗腫瘤作用機(jī)制,本文作者首次采用紫外光譜動力學(xué)方法測定了冬凌草甲素和冬凌草乙素與谷胱苷肽的邁克爾加成反應(yīng)級數(shù)、速率常數(shù)和平衡常數(shù).

    1 實驗部分

    1.1 試劑及儀器

    SHIMADZU UV 2550型紫外可見分光光度計(日本島津公司).冬凌草甲素(≥98%,南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司),冬凌草乙素(≥98%,河南濟(jì)源濟(jì)世藥業(yè)有限公司),還原型谷胱甘肽(GSH,≥98%,阿拉丁試劑(上海)有限公司).

    1.2 冬凌草甲素和冬凌草乙素與GSH邁克爾加成反應(yīng)貯備溶液的配制

    稱取KH2PO41.36g溶于30.4mL 0.1mol/L NaOH溶液中,加蒸餾水至200mL得pH=6.5的磷酸鹽緩沖液.取pH=6.5的磷酸鹽緩沖液和甲醇等體積混勻得pH=6.5的磷酸鹽緩沖液-甲醇(1∶1,V∶V)溶液.精確稱取冬凌草甲素13.10mg、冬凌草乙素13.03mg和谷胱甘肽11.06mg,分別置于25mL容量瓶內(nèi),用pH=6.5的磷酸鹽緩沖液-甲醇(1∶1)溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,得1.44×10-3mol/L冬凌草甲素、冬凌草乙素和谷胱甘肽反應(yīng)貯備溶液.

    1.3 冬凌草甲素(或冬凌草乙素)吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    精確量取1mL 1.44×10-3mol/L冬凌草甲素(或冬凌草乙素)反應(yīng)貯備溶液六份分別置于50mL刻度試管中,分別加入50、75、100、125、200和375μL冰醋酸,搖勻,再分別加入1mL 1.44×10-3mol/L谷胱甘肽反應(yīng)貯備溶液,用pH=6.5的磷酸鹽緩沖液-甲醇溶液分別稀釋至4、6、8、10、16和30mL,搖勻,得3.60×10-4、2.40×10-4、1.80×10-4、1.44×10-4、9.00×10-5、4.80×10-5mol/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液.以等體積pH=6.5的磷酸鹽緩沖液-甲醇溶液代替冬凌草甲素(或冬凌草乙素)反應(yīng)貯備溶液,同標(biāo)準(zhǔn)溶液制備方法制備系列空白溶液.以空白溶液為參比,立即在240nm波長處測定吸光度,繪制冬凌草甲素(或冬凌草乙素)的吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(A-c).前期實驗結(jié)果表明,在待測反應(yīng)體系中加入冰醋酸作為反應(yīng)終止劑后,冬凌草甲素和冬凌草乙素與GSH邁克爾加成反應(yīng)非常緩慢,可以忽略不計.

    1.4 冬凌草甲素和冬凌草乙素與GSH的邁克爾加成反應(yīng)紫外光譜動力學(xué)研究

    控制反應(yīng)溫度為25℃,于10mL試管中加入冬凌草甲素(或冬凌草乙素)和GSH反應(yīng)貯備溶液各2 mL,混勻,得初始濃度為0.72μmol/L冬凌草甲素(或冬凌草乙素)反應(yīng)液.以240nm為檢測波長,立即進(jìn)行紫外動力學(xué)測定,記錄吸光度隨反應(yīng)時間變化的曲線(A-t),至吸光度不再變化.冬凌草甲素和冬凌草乙素與GSH邁克爾加成反應(yīng)方程式見圖1.

    2 結(jié)果與討論

    2.1 冬凌草甲素(或冬凌草乙素)吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    采用紫外分光光度法分別建立了冬凌草甲素和冬凌草乙素的吸光度-濃度(A-c)標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程為:冬凌草甲素A=8.010 1c-0.006 6(c:μmol/L),相關(guān)系數(shù)R=0.999 6,線性范圍為0.048~0.360 μmol/L;冬凌草乙素A=5.280 4c+0.030 9,相關(guān)系數(shù)R=0.999 5,線性范圍為0.048~0.360μmol/L.

    2.2 冬凌草甲素和冬凌草乙素與GSH的邁克爾加成反應(yīng)紫外光譜動力學(xué)研究

    采用紫外光譜動力學(xué)法測定了冬凌草甲素和冬凌草乙素與GSH的邁克爾加成反應(yīng)動力學(xué)性質(zhì).加成反應(yīng)吸光度隨反應(yīng)時間變化如圖2所示.從圖2可以看出,隨著反應(yīng)時間的增加,反應(yīng)體系的吸光度均逐漸下降,吸光度下降快慢速度順序為:冬凌草甲素>冬凌草乙素,說明冬凌草甲素反應(yīng)速度比冬凌草乙素快.根據(jù)冬凌草甲素(或冬凌草乙素)吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計算吸光度對應(yīng)濃度值,并以濃度倒數(shù)對反應(yīng)時間作圖(圖3).從圖3可以看出,在反應(yīng)時間0~600s內(nèi),反應(yīng)物濃度倒數(shù)與反應(yīng)時間基本呈線性關(guān)系,線性回歸方程為:冬凌草甲素1/c=16.196 0t+3 917.8(c:mol/L,t:s),相關(guān)系數(shù)R=0.997 7;冬凌草乙素1/c=7.480 5t+3 148.7,相關(guān)系數(shù)R=0.995 2.說明在反應(yīng)初始階段,冬凌草甲素和冬凌草乙素與GSH的邁克爾加成反應(yīng)符合二級動力學(xué)方程,速率常數(shù)分別為16.196 0L·(mol·s)-1(冬凌草甲素)和7.480 5L·(mol·s)-1(冬凌草乙素).冬凌草甲素與GSH的邁克爾加成反應(yīng)速率比冬凌草乙素快一倍以上.這可能是因為冬凌草乙素的14位羥基在變成縮醛后,破壞了原羥基與15位羰基形成的分子內(nèi)氫鍵,降低了雙鍵的親電性導(dǎo)致邁克爾加成反應(yīng)活性下降所致.

    圖1 冬凌草甲素和冬凌草乙素與GSH的邁克爾加成反應(yīng)方程式Fig.1 The reaction scheme of oridonin and ponicidin with glutathione

    圖2 冬凌草甲素和冬凌草乙素與GSH的邁克爾加成反應(yīng)吸光度隨反應(yīng)時間變化曲線Fig.2 Plots of the absorbance of oridonin and ponicidin versus reaction time

    圖3 冬凌草甲素和冬凌草乙素與GSH的邁克爾加成反應(yīng)濃度倒數(shù)隨反應(yīng)時間變化曲線Fig.3 Plots of the reciprocal of concentration of oridonin and ponicidin versus reaction time

    2.3 冬凌草甲素和冬凌草乙素與GSH的邁克爾加成反應(yīng)平衡常數(shù)測定

    冬凌草甲素與GSH的邁克爾加成反應(yīng)接近30min后反應(yīng)體系吸光度基本不變(約為0.41),說明反應(yīng)已趨于平衡.而冬凌草乙素與GSH的邁克爾加成反應(yīng)接近55min后反應(yīng)體系吸光度才基本不變(約為0.42),說明這時反應(yīng)已趨于平衡.根據(jù)反應(yīng)物初始濃度、反應(yīng)體系平衡時吸光度值以及吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線求得平衡轉(zhuǎn)化率α為92.78%(冬凌草甲素)和89.76%(冬凌草乙素),并由平衡常數(shù)計算公式K=α/(1-α)2求得25℃條件下,冬凌草甲素和冬凌草乙素與GSH的邁克爾加成反應(yīng)的平衡常數(shù)分別為177.98L/mol和85.60L/mol.說明冬凌草甲素加成反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率比冬凌草乙素高,反應(yīng)更徹底.

    3 結(jié)論

    冬凌草甲素和冬凌草乙素與GSH的邁克爾加成反應(yīng)符合二級動力學(xué)方程,綜合邁克爾加成反應(yīng)速率、平衡轉(zhuǎn)化率和平衡常數(shù)測定結(jié)果,冬凌草甲素與GSH的邁克爾加成反應(yīng)活性比冬凌草乙素高得多.根據(jù)反應(yīng)活性,本文作者推測冬凌草甲素的抗腫瘤活性可能比冬凌草乙素更好,這與文獻(xiàn)[6]報道的冬凌草甲素比冬凌草乙素具有更好抗腫瘤活性相一致.

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