香豆素-亞胺型Cu2＋識(shí)別熒光探針的合成及性能

王建紅，郭心靈，趙會(huì)君，羅朝陽(yáng)，侯旭鋒，2，趙 瑾＊

（1.河南大學(xué) 天然藥物與免疫工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開(kāi)封 475004；2.許昌學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，河南 許昌 461000）

銅是人體內(nèi)必需的微量元素，能參與多種生理過(guò)程并發(fā)揮重要作用［1-3］.它通過(guò)與金屬硫蛋白結(jié)合來(lái)影響一些生物酶（如過(guò)氧化物歧化酶，細(xì)胞色素氧化酶，酪胺酸酶等）的活性，在細(xì)胞呼吸作用、氧化防御及神經(jīng)遞質(zhì)傳遞等過(guò)程中顯示生物活性［4-5］.研究表明，人體內(nèi)銅元素水平與多種疾病如心血管疾病、糖尿病、癌癥和神經(jīng)退行性疾病等密切相關(guān)［6-9］，因此設(shè)計(jì)、合成能夠識(shí)別和檢測(cè)生物體內(nèi)Cu2＋的熒光探針對(duì)于相關(guān)疾病的診斷具有重要意義.

熒光探針檢測(cè)金屬離子具有方便、快捷、靈敏度高、對(duì)樣品無(wú)損害等優(yōu)點(diǎn)，因而顯示出廣闊的應(yīng)用前景，特別是在環(huán)境污染、生物檢測(cè)等領(lǐng)域的應(yīng)用受到廣泛的關(guān)注［10-14］.目前，已報(bào)道的Cu2＋選擇性檢測(cè)熒光探針母核主要有熒光素類、羅丹明類、菁染料類及萘酰亞胺類等［15-17］.香豆素類化合物具有熒光量子產(chǎn)率高、熒光發(fā)射波長(zhǎng)適中、斯托克斯（Stokes）位移大、光穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，特別需要指出的是其還具有良好的膜透性和良好的生物相容性，使得香豆素類熒光探針的設(shè)計(jì)、合成成為一個(gè)新興的研究熱點(diǎn).

本文中作者基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（Intramolecular Charge Transfer，ICT）理論，在香豆素母核上引入鄰羥基芳香亞胺結(jié)構(gòu)，利用金屬離子對(duì)鄰羥基亞胺的配位作用實(shí)現(xiàn)離子識(shí)別［18］.目標(biāo)化合物形成的O-N-O金屬配合中心，能選擇性配位Cu2＋.當(dāng)Cu2＋與其配位后，氮原子上的孤對(duì)電子被金屬離子束縛，因而不能發(fā)生光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致體系的熒光猝滅.在合成探針3的基礎(chǔ)上，利用熒光滴定光譜實(shí)驗(yàn)研究了探針識(shí)別Cu2＋的選擇性及靈敏度，并初步驗(yàn)證了探針的識(shí)別機(jī)制.熒光探針的合成路線如圖1所示.

圖1 熒光探針3的合成路線Fig.1 The synthetic route of probe 3

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Bruker ultraflextreme MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀、奧利龍Model 420pH計(jì)、Varian Cary Eclipse熒光光譜儀、Shimadzu UV-2350紫外光譜儀、VarianINOVA-400型核磁共振儀、X-6精密熔點(diǎn)測(cè)定儀.

2，4-二羥基苯甲醛、乙酰谷氨酸、醋酸酐、4-二乙氨基水楊醛、硝酸鹽等均為市售分析純，光譜測(cè)定所用溶劑為色譜級(jí)（阿拉丁試劑有限公司），金屬離子溶液、HEPES緩沖溶液均按照標(biāo)準(zhǔn)方法配制.

1.2 3-氨基7-羥基香豆素的合成

將2，4-二羥基水楊醛（2.76g，20mmol）、乙酰谷氨酸（2.34g，20mmol）、無(wú)水醋酸鈉60mmol加入100mL醋酸酐溶液中，加熱回流反應(yīng)6h，反應(yīng)液倒入碎冰（300mL）中得到黃色絮狀沉淀，抽濾，用冰水洗滌濾餅，剩余物在30mL HCl與乙醇的混合溶劑（V（HCl）∶V（乙醇）＝2∶1）中加熱回流1h，然后將溶液倒入冰水（100mL）中，加入30%NaOH調(diào)節(jié)pH至5～6，有大量絮狀沉淀生成，將溶液濃縮至30mL，得到粗品，乙醇重結(jié)晶得到黃色固體1（2.12g）.產(chǎn)率61%.m.p.232.1～234.6℃；1H NMR（400MHz，DMSO）δ：9.82（s，1H），7.23（d，J＝8.4Hz，1H），6.67（dt，J＝8.1，2.2Hz，3H），5.24（s，2H）.

1.3 2-（3-（4-二乙氨基-2-羥基）苯甲醛）-7-羥基-香豆素的合成

將3-氨基-7-羥基香豆素1（1.77g，10.0mmol），4-二乙氨基水楊醛（1.93g，10.0mmol）和冰醋酸（0.1 mL）加入無(wú)水乙醇（60mL）中，在N2保護(hù)下，加熱回流反應(yīng)12h，冷卻有大量黃棕色固體生成，沉淀經(jīng)過(guò)濾，水洗，干燥，用無(wú)水乙醇重結(jié)晶得到2.產(chǎn)率87%.m.p.151.5～151.7℃；1H NMR（400MHz，CDCl3）δ：13.54（s，1H），8.90（s，1H），7.83（s，1H），7.46（d，J＝8.6Hz，1H），7.27（d，J＝8.9Hz，1H），6.75（dd，J＝8.5，1.8Hz，1H），6.67（s，1H），6.31（dd，J＝8.9，2.2Hz，1H），6.05（d，J＝2.1Hz，1H），3.58（s，1H），3.41～3.36（m，4H），1.11（t，J＝7.0Hz，6H）.13C NMR（100MHz，DMSO）：δ：163.6，162.2，161.5，158.6，153.5，151.9，134.1，129.1，128.9，128.5，114.3，111.1，108.8，104.1，102.1，96.8，44.1，12.6.ESI-HRMS（m/z）：Calcd.For C20H20N2O4（［M＋H］＋）：353.149 6；Found：353.149 5.

1.4 （3-（4-二乙氨基-2-羥基）苯甲醛）-7-甲氧基-香豆素的合成

將化合物2（281mg，1.0mmol）、碳酸鉀（250mg）加入無(wú)水丙酮（10mL）中，在0℃條件下，將碘甲烷（200mg，1.4mmol）緩慢加入反應(yīng)溶液中，TLC跟蹤反應(yīng)，回流反應(yīng)10h，趁熱將反應(yīng)液抽濾，濾餅用丙酮沖洗，合并濾液，將濾液旋干，用乙酸乙酯（50mL）萃取，有機(jī)層經(jīng)干燥、旋干、柱層析分離［V（石油醚）∶V（丙酮）＝3∶1］后得黃色固體3（296mg）.產(chǎn)率81%.m.p.193.8～196.2℃.1H NMR（400MHz，CDCl3）δ：13.56（s，1H），9.19（s，1H），7.50（s，1H），7.39（d，J＝8.5Hz，1H），7.18（d，J＝8.8Hz，1H），6.86（dt，J＝7.0，2.4Hz，2H），6.25（dd，J＝8.8，2.5Hz，1H），6.16（d，J＝2.4Hz，1H），3.87（s，3H），3.40（q，J＝7.1Hz，4H），1.21（t，J＝7.1Hz，6H）.13C NMR（100MHz，CDCl3）δ：164.1，163.6，161.9，158.8，153.4，152.2，134.6，131.2，129.9，128.5，113.7，113.0，109.4，104.2，100.5，97.7，55.9，44.7，12.8.ESI-HRMS（m/z）：Calcd.For C21H22N2O4（［M＋H］＋）：367.165 2；Found：367.165 8.

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物的結(jié)構(gòu)確認(rèn)

目標(biāo)化合物3的NMR信號(hào)中出現(xiàn)δ13.56峰，該質(zhì)子峰應(yīng)歸屬于分子內(nèi)的氫鍵信號(hào)，這是由于其結(jié)構(gòu)中存在鄰羥基亞胺，容易形成分子內(nèi)氫鍵.與此類似，化合物2也出現(xiàn)同樣現(xiàn)象，其分子內(nèi)氫鍵的質(zhì)子信號(hào)為δ 13.54.同時(shí)，化合物2中存在的另一個(gè)酚羥基（香豆素母核）屬于孤立的酚羥基，其質(zhì)子信號(hào)出現(xiàn)在δ3.5～3.7，為一寬峰.兩個(gè)化合物中的其余質(zhì)子信號(hào)均與其結(jié)構(gòu)一一對(duì)應(yīng).

2.2 探針對(duì)不同金屬離子的選擇性

為了考察目標(biāo)化合物對(duì)不同金屬離子的選擇性，采用熒光光譜法測(cè)試了常見(jiàn)金屬離子對(duì)探針3的熒光光譜的影響（見(jiàn)圖2）.探針3具有較強(qiáng)的熒光發(fā)射性質(zhì)，在440nm波長(zhǎng)激發(fā)下，在524nm處出現(xiàn)較強(qiáng)的熒光發(fā)射峰.當(dāng)向探針3的溶液（10μmol/L）中分別加入100μmol/L的Fe3＋、Mn2＋、Ag＋、Cr3＋、Cd2＋、Pb2＋、Hg2＋、Ca2＋等金屬離子后，524nm處的熒光幾乎不變，表明化合物3與這些離子沒(méi)有相互作用.

當(dāng)向探針3的溶液中分別加入Co2＋，F(xiàn)e2＋時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度明顯降低，表明Co2＋，F(xiàn)e2＋與目標(biāo)化合物存在一定程度的相互作用.值得注意的是，當(dāng)加入Cu2＋時(shí)，探針3的熒光幾乎完全猝滅.上述結(jié)果表明探針3對(duì)Cu2＋具有顯著的選擇性.香豆素是一種經(jīng)典的熒光發(fā)射團(tuán)，特別是其7-位和3-位取代基的電子“推-拉”作用，能夠影響香豆素的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）過(guò)程，進(jìn)而改變其熒光發(fā)射性質(zhì).化合物3在香豆素3-位上引入3鄰羥基亞胺，有助于香豆素的ICT過(guò)程，因而顯示出較強(qiáng)的熒光發(fā)射光譜.同時(shí)，由于鄰羥基亞胺結(jié)構(gòu)提供了合適的配體環(huán)境，能夠與銅離子發(fā)生配位，而Cu2＋自身具有順磁性，往往導(dǎo)致體系的熒光猝滅（圖3）［18］.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cu2＋能與化合物3發(fā)生配位作用，阻礙化合物的ICT過(guò)程，導(dǎo)致熒光猝滅.

圖2 探針3溶液（10μmol/L）中加入不同金屬離子時(shí)的熒光發(fā)射光譜Fig.2 Fluorescence emission spectra of probe 3 solution（10μmol/L）upon addition of various metal ions

圖3 熒光猝滅機(jī)制Fig.3 The proposed mechanism of fluorescence quenching

2.3 探針對(duì)銅離子的響應(yīng)性質(zhì)

利用熒光滴定實(shí)驗(yàn)考察探針對(duì)銅離子的響應(yīng)性質(zhì).如圖4所示，在HEPES buffer（0.1mol/L，pH＝7.4，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的CH3CN）中，加入不同濃度的Cu2＋，測(cè)試探針3（10μmol/L）的熒光光譜.結(jié)果顯示，隨著Cu2＋加入量的增加，探針3的熒光發(fā)射強(qiáng)度逐漸降低.當(dāng)加入等物質(zhì)的量的Cu2＋時(shí)，探針3在524 nm處的熒光完全猝滅，且熒光強(qiáng)度與Cu2＋濃度在0.66～10μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，最低檢出限可達(dá)0.8μmol/L.Job分析法表明化合物3與金屬離子以1∶1比例結(jié)合形成絡(luò)合物（見(jiàn)圖5）.

圖4 探針3（10μmol/L）在HEPES緩沖溶液中加入不同濃度Cu2＋的熒光變化Fig.4 Emission spectra of 3（10μmol/L）in HEPES buffer upon addition of various concentrations of Cu2＋

圖5 探針3與Cu2＋絡(luò)合的Job-plot圖Fig.5 The Job-plot of probe binding to Cu2＋

3 結(jié)論

基于香豆素母核結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)、合成了具有Cu2＋高選擇性識(shí)別的香豆素類熒光分子探針.該探針對(duì)Cu2＋有較好的選擇性和靈敏度，檢出限達(dá)到0.8μmol/L；并且在0.66～10μmol/L范圍內(nèi)，探針的熒光強(qiáng)度與其濃度有良好的線性關(guān)系，可以定量檢測(cè)該范圍內(nèi)的Cu2＋.本文為有機(jī)及生物環(huán)境中的Cu2＋識(shí)別檢測(cè)提供了一種有效的分子熒光探針.

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