軟皮湯對硬皮病小鼠模型皮膚組織中p-SMAD3、FLI1因子表達的影響

齊 慶，李永賢，陳英杰，李東海，朱 珂，查旭山

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院、第一附屬醫(yī)院皮膚科，廣東 廣州510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院2009 級本科班，廣東 廣州510405）

軟皮湯來源于鄧鐵濤教授治療硬皮病的理論——硬皮病治療時應(yīng)以補腎益精為主，健脾養(yǎng)肺為輔。 軟皮湯能減輕患者皮膚硬化癥狀，其具體機制仍不明確[1-2]。 前期研究提示，在體外其作用靶向于TGF-β 通路[3-4]，可能與活化因子SMAD3、抑制因子FLI1 之間的平衡變化有關(guān)[5]。 然而，機體復(fù)雜的微環(huán)境有別于體外細胞模型，諸多因素影響細胞因子作用；因此，有必要深入開展相關(guān)體內(nèi)研究。 本研究將基于小鼠硬皮病模型，繼續(xù)探討軟皮湯在體內(nèi)對TGF-β 通路中SMAD3、FLI1 等因子“平衡”的影響，現(xiàn)將方法與結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性C57BL/6J 小鼠30 只，6～8 周齡， 體質(zhì)量（20.0±1.4）g，購于中山大學(xué)實驗動物中心，合格證NO.44008500000277。

1.2 主要試藥與試劑

中藥：補腎益精復(fù)方軟皮湯處方來源于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科， 藥物組成： 阿膠10 g，山茱萸10 g，熟地黃20 g，黃芪30 g，山藥30 g，茯苓15 g，川紅花5 g。 加蒸餾水1 200 mL，浸泡20 min 后， 沸煮45 min， 過濾收集藥液。100 ℃水浴蒸發(fā)， 使藥液濃縮至134 mL （生藥量0.9 g/mL）。 博來霉素bleomycin（#9041-93-4）購于Aladin 公司。 Masson 染色試劑盒購于南京建成生物工程研究所 （#D026）。 抗體：CollagenⅠ(#sc8788)、FLI1 (#sc356) 購 于Santa cruz 公 司；Fibronectin(#ab2413) 購 于Abcam 公 司；SAMD3 （#9532），p-SMAD3（#8828），β-Actin（#3700）購于Cell signaling technology 公司。 ECL 發(fā)光試劑盒購于廣州永諾生物科技有限公司（#F0010）。

1.3 主要儀器

AB-160 型電子分析天平 （美國Denver 公司）；Power Tone XL 超薄切片機 （美國Boeckeler RMC 公司）；Olympus BXDX 光學(xué)顯微鏡 （日本Olympus 公司）；微型電泳電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；BX 51 光學(xué)顯微鏡照相系統(tǒng) （日本Olympus 公司）；CR 21G 高速冷凍離心機 （日本Hitachi 公司）。

1.4 造模與藥物處理[6]

動物隨機分成3 組，每組10 只，實驗前在小鼠背部中央（1 cm×1 cm）剃去毛發(fā)。 正常對照組：以PBS 溶液100 μL 每日同一位點注射1 次， 生理鹽水(0.2 mL/10 g)每日灌胃1 次。模型對照組：博來霉素PBS 溶液1 mg/mL 100 μL 每日同一位點注射1次，生理鹽水(0.2 mL/10 g)每日灌胃1 次。軟皮湯處理組：博來霉素PBS 溶液1 mg/mL 100 μL 每日同一位點注射1 次， 生藥量0.9g/mL 軟皮湯0.2 mL/10 g 灌胃，每日1 次。 連續(xù)處理4 周后，處死動物，收取注射區(qū)域皮膚。

1.5 Masson 染色

皮膚組織經(jīng)多聚甲醛固定、 石蠟包埋后，5 μm連續(xù)切片。 染色前，石蠟切片經(jīng)過脫蠟、水化處理。本實驗按照Masson 染色試劑盒的方法開展：（1）細胞核染液染色2 min，倒掉細胞核染色液，沖水30 s；（2）胞漿染液染色40 s，倒掉胞漿染色液，沖水30 s；（3）分色液分色8 min；（4）藍色復(fù)染液染色3 min， 倒掉復(fù)染液， 無水乙醇沖洗干凈；（5）吹干后用無毒環(huán)保封固劑封片、鏡檢。

1.6 蛋白提取

稱取約100 mg 的組織物， 記下質(zhì)量， 加入700 μL 4 ℃預(yù)冷PBS，剪碎。 點動離心，重復(fù)3～4次， 倒去PBS。 加入RIPA 300 μL/100 mg 組織，vortex 震蕩。勻漿機勻漿5～8 min。設(shè)置聲儀：超聲強度37%，0.8 s/次。超聲12～15 次。16 000 g，4 ℃，離心30 min。 離心結(jié)束后取中間層液體-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 檢測方法

Western Blot 蛋白定量后， 經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)膜。 5%脫脂牛奶封閉后，一抗4 ℃孵育過夜。 用TBST 洗膜2 次，每次7 min。 HRP 標(biāo)記二抗室溫下孵育1～2 h，用TBST 洗3 次，每次7 min。進行化學(xué)發(fā)光顯影。 用Image J 分析目標(biāo)條帶的光密度值。 以β-Actin 為內(nèi)參照， 比較CollagenⅠ、FLI1、Fibronectin、SAMD3 蛋白表達的差異。CollagenⅠ、FLI1、Fibronectin、SAMD3 的相對蛋白表達量=各個蛋白的光密度值/β-Actin 光密度值。p-SMAD3 相對表達量=各組樣本p-SMAD3 光密度值/ SAMD3光密度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Masson 三色染色觀察硬皮病小鼠皮膚纖維化程度

經(jīng)過Masson 三色染色病理切片，正常組纖維層染色最淺，軟皮湯組稍高；模型組染色最深，顯示其組織的纖維化明顯。 由此可見，硬皮病小鼠經(jīng)過軟皮湯干預(yù)后，病變皮膚纖維化程度減輕，趨向正常水平。 如圖1 所示（見封三彩圖）。

2.2 各組小鼠皮膚組織CollagenⅠ和Fibronectin 蛋白表達水平的比較

小鼠皮膚CollagenⅠ和Fibronectin 的蛋白表達水平，在模型對照組均高于正常對照組和軟皮湯組（P＜0.05）。 表明軟皮湯可不同程度抑制模型小鼠皮膚中膠原相關(guān)因子CollagenⅠ、Fibronectin 的表達。見表1。

表1 各組小鼠皮膚組織CollagenⅠ和Fibronectin 表達（±s）

表1 各組小鼠皮膚組織CollagenⅠ和Fibronectin 表達（±s）

注：與正常對照組比較*P＜0.05；與模型對照組比較#P＜0.05。 下表同。

組 別正常對照組模型對照組軟皮湯組n 10 10 10 Collagen Ⅰ1.00±0.05 3.52±0.16*1.22±0.05*#Fibronectin 1.00±0.04 2.58±0.14*1.31±0.07*#

2.3 各組小鼠皮膚組織中FLI1、SMAD3、p-SMAD3蛋白表達水平比較

SMAD3 在各組中的蛋白表達水平無明顯差異；FLI1 的表達水平在模型對照組中均低于正常對照組和軟皮湯組。p-SMAD3 在模型對照組中的表達水平均明顯高于正常對照組和軟皮湯組（P＜0.05）。 結(jié)果顯示， 在硬皮病小鼠皮膚模型中，TGF-β 途徑的p-SMAD3/FLI1 因子表達比值增大， 而經(jīng)過軟皮湯干預(yù)后，該比值有一定程度下降，雖與正常組仍有一定差距，但已趨向正常水平。 見表2。

表2 各組小鼠皮膚組織FLI1、p-SMAD3、SMAD3 的表達（±s）

表2 各組小鼠皮膚組織FLI1、p-SMAD3、SMAD3 的表達（±s）

組 別正常對照組模型對照組軟皮湯組n 10 10 10 FLI1 1.00±0.04 0.33±0.02*0.92±0.05 p-SMAD3 1.00±0.03 4.62±0.23*1.53±0.08*#SMD3 1.00±0.03 0.98±0.05 1.02±0.05

3 討論

硬皮病是復(fù)雜的自身免疫性疾病，臨床辨病呈現(xiàn)病譜性變化，病譜一端為局限性硬皮病，另一端為彌漫型系統(tǒng)性硬皮病，兩者之間包括CREST 綜合征、Sine 硬皮病、嗜酸性筋膜炎等。 中醫(yī)辨證分型主要分為肺脾虧虛型與脾腎虧損型。 雖存異質(zhì)性變化，然其核心病理均不同程度在于：血管損傷、自身免疫、皮膚與內(nèi)臟器官纖維化。 優(yōu)良的動物模型是硬皮病研究的重要工具， 相對硬皮病細胞模型，硬皮病小鼠能更好地模擬疾病的體內(nèi)復(fù)雜微環(huán)境以及核心病理變化。 本研究使用博萊霉素局部注射構(gòu)建硬皮病小鼠模型[6]，可在機體內(nèi)產(chǎn)生活性氧，誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)，刺激成纖維細胞合成膠原。 在注射博萊霉素后， 小鼠逐漸出現(xiàn)局部皮膚萎縮變硬、毛發(fā)脫落、活動減少、食量下降、發(fā)育延緩、體質(zhì)量減輕等表現(xiàn)。 由此可見，該疾病模型體現(xiàn)了硬皮病的主要癥狀，且一定程度地模擬了臨床硬皮病患者的肺脾腎虛損之證。

針對硬皮病肺脾腎虛損，依“損者益之，虛者補之”補益原則，鄧鐵濤教授主張硬皮病治療宜肺脾腎同治、補腎益精為法[1]。 據(jù)此，擬定治療硬皮病的補腎益精法軟皮湯：熟地黃補腎為君；黃芪、淮山藥、阿膠補脾肺，養(yǎng)陰血，引藥直達肌表之功為臣；山茱萸、茯苓加強補益脾腎之效為佐；紅花為使，使諸藥補而不滯；全方共奏健脾養(yǎng)肺、補腎益精之效。在臨證中，軟皮湯中藥復(fù)方能不同程度改善患者纖維化癥狀[1-2]。 前期實驗提示，軟皮湯體外作用靶向于TGF-β 通路，與SMAD3、FLI1 平衡變化相關(guān)[5，7]。據(jù)此，本課題組提出SMAD3/FLI1“平衡”的概念。 研究顯示，硬皮病小鼠SMAD3、FLI1 因子失衡，軟皮湯中藥復(fù)方可使硬皮病小鼠TGF-β 通路中活化因子SMAD3 與抑制因子FLI1 再平衡，皮膚纖維化程度減輕，Ⅰ型膠原蛋白、纖維連接蛋白分泌減少。

SMAD3、FLI1 同屬保守的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)，可相互結(jié)合成組織限制性異二聚體， 參與細胞增殖與組織特異性分化[8]。 在纖維化過程中， 二者均處于TGFβ 通路下游，效應(yīng)部位位于細胞核內(nèi)。 當(dāng)TGF-β 通路靜息時，F(xiàn)LI1 與膠原蛋白啟動子結(jié)合， 抑制膠原蛋白轉(zhuǎn)錄；當(dāng)TGF-β 通路活化時，SMAD3 競爭FLI1的啟動子結(jié)合位點，促進膠原蛋白轉(zhuǎn)錄[9-10]。 本研究顯示，軟皮湯組、模型對照組與正常對照組活化因子SMAD3 表達量并無統(tǒng)計學(xué)差異， 而三組間主要差異在于磷酸化的SMAD3 因子（p-SMAD3）；軟皮湯使硬皮病小鼠p-SMAD3 減少， 趨向正常對照組水平，而對SMAD3 量無明顯影響；提示中藥復(fù)方對活化因子SMAD3 的調(diào)節(jié)可能與磷酸化有關(guān)。與國外研究一致， 磷酸化的SMAD3 因子才是TGF-β 通路活化的標(biāo)志；未磷酸化的SMAD3 位于胞漿內(nèi)；僅當(dāng)TGF-β 通路活化，SMAD3 被TGF-βⅠ型受體磷酸化，與協(xié)同性SMADs 形成復(fù)合物后進入核內(nèi)，激活膠原相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[11]。 同時，軟皮湯中藥復(fù)方增加了硬皮病小鼠體內(nèi)的抑制因子FLI1 表達，使其趨向正常水平， 可能增強了對膠原蛋白基因轉(zhuǎn)錄的抑制[9]。然而，中藥復(fù)方通過何種途徑影響了抑制因子FLI1的表達，其機制仍不明確，需要更進一步研究。

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圖1 各組大鼠回盲部腸黏膜切片電鏡觀察圖（HE，×400）