探討維族食管鱗癌病人Hp感染與癌細胞增殖及侵襲的關(guān)聯(lián)研究

金澄宇 郭 睿 馬金山 努爾蘭 李先鋒(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院胸外科，烏魯木齊 830001)

食管癌是原發(fā)于食管黏膜上皮的惡性腫瘤，尤其是食管鱗狀細胞癌，發(fā)病率在全世界存在著較大的區(qū)域性、種族性和民族差異性［1］。在我國的新疆地區(qū)，哈薩克族和維吾爾族的發(fā)病率高居不下，分別名列第一、二位。近來研究發(fā)現(xiàn)，幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori，Hp)感染與食管癌的關(guān)系十分密切［2］。Ki67是增殖細胞核抗原，表達于除G0、G1早期以外的細胞周期中，是可靠而全面地反映細胞群體增殖活性的客觀指標(biāo)［3］?；|(zhì)金屬蛋白酶2(Maixmetalloproteinases2，MMP2)是 MMPs家族的一員，可以降解細胞外基質(zhì)，促進新生血管的形成，促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［4］。為探討Hp感染與腫瘤增殖和侵襲惡性程度的關(guān)聯(lián)，本文采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測新疆維族食管鱗癌組織中Hp感染與Ki67和MMP2的表達情況。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集我院2010年1月至2013年6月原發(fā)性食管鱗癌手術(shù)切除病理組織石蠟標(biāo)本164例，所有患者術(shù)前未經(jīng)放化療治療。男性118例，女性46例，年齡20～80歲，平均年齡56.6歲，皆為維吾爾族。另選擇我院30例創(chuàng)傷死亡尸檢標(biāo)本的食管組織作為對照組，該組標(biāo)本均經(jīng)組織學(xué)確認為正常組織。其中男性17例，女性13例，年齡 32～78歲，平均年齡54.1歲，皆為維吾爾族。兩組在年齡、性別方面無顯著性差異(P＞0.05)。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林液固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，并均經(jīng)HE染色后確認病理診斷，臨床資料完整。

1.2 試劑和方法

1.2.1 主要試劑 兔抗人 Hp抗體(Abcam，1∶1 000)、兔抗人 Ki67抗體(Abcam，1∶100)均購自武漢博士德生物工程有限公司;鼠抗人MMP-2抗體(Abcam，1∶1 000)購自上海太陽生物技術(shù)有限公司;免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 采用SP法二步，Hp陽性對照組織為正常胃組織;Ki67陽性對照組織為正常扁桃體組織，MMP2陽性對照組織為乳腺癌組織。PBS替代一抗作為陰性對照。

1.2.3 結(jié)果判定 采用雙盲法觀察陽性反應(yīng)。Hp陽性表達定位于細胞質(zhì)，陽性部位呈棕黃色;而Ki67陽性表達定位于細胞核，陽性部位呈棕黃色。無棕黃色表達者為陰性。MMP2陽性表達定位于細胞質(zhì)。隨機選擇10個高倍視野(放大倍數(shù)400倍)，每個視野計數(shù)200個細胞，計算陽性細胞數(shù)所占的百分?jǐn)?shù)均值，當(dāng)此均值 ＞10%即為陽性表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 本實驗研究數(shù)據(jù)用率或者百分?jǐn)?shù)表示，使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行相關(guān)統(tǒng)計學(xué)處理，組間比較采用卡方檢驗，兩變量關(guān)聯(lián)性分析采用卡方檢驗及Spearman等級相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌及對照組中Hp、Ki67和MMP2抗原檢測結(jié)果 Hp、Ki67和MMP2在食管癌及對照組中的表達情況依次如圖1所示，食管癌中Hp陽性率81.7%，對照組Hp陽性率26.7%。食管癌組與對照組比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=39.16，P＜0.01)，見表1。食管癌中Ki67陽性率67.1%，對照組Ki67陽性率6.67%，食管癌組與對照組比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=37.92，P＜0.01)，見表1。食管癌中MMP2陽性率86.6%，對照組MMP2陽性率13.4%，食管癌組與對照組比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=47.07，P＜0.01)，見表1。

2.2 食管癌及對照組中Hp感染與Ki67抗原表達的相關(guān)性 表2示，食管鱗癌患者中Hp陽性表達組的Ki67抗原的陽性表達率明顯高于Hp陰性組。分析表明，食管癌中Hp的檢出率與Ki67抗原陽性表達密切相關(guān)(rs=0.340，P＜0.01)，見表2。

2.3 食管癌及對照組中Hp感染與MMP2抗原表達的相關(guān)性 表3示，食管鱗癌患者中Hp陽性表達組的MMP2抗原的陽性表達率高于Hp陰性組。分析表明，食管癌中Hp的檢出率與MMP2抗原陽性表達密切相關(guān)(rs=0.739，P＜0.01)，見表3。

圖1 食管癌組織與對照組中Hp、Ki67和MMP2的表達情況Fig.1 Expression of Hp(A，D)，Ki67(B，E)and MMP2(C，F(xiàn))in tissues of esophageal carcinoma and control group

表1 食管癌及對照組中Hp、Ki67和MMP2抗原檢測結(jié)果Tab.1 Results of antigen(Hp，Ki67，MMP2)detection for esophageal carcinoma and control group

表2 食管癌Hp表達與Ki67表達的關(guān)系Tab.2 Relationship between Hp expression and Ki67 expression in esophageal carcinoma cells

表3 食管癌Hp表達與MMP2表達的關(guān)系Tab.3 Relationship between Hp expression and MMP2 expression in esophageal carcinoma cells

3 討論

世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)已將Hp納入第一類致癌原，隨著對Hp致病性的深入研究，Hp感染在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用已引起人們注意，有關(guān)Hp與食管癌研究的報道也隨之增加。有研究指出，人群中食管的Hp感染率約為胃的Hp感染率的1/3，而在食管鱗癌中，Hp檢出率很高，且與食管鱗癌癌變的好發(fā)部位是一致的［5］。我國Hp感染率為40%～60%，但存在很大的地區(qū)差異。本實驗表明，Hp在維族中感染率很高，且與食管癌的發(fā)生有重要的關(guān)系。本結(jié)果與其他認為新疆維族Hp感染率明顯低于國內(nèi)平均水平的研究相反［6］。

Ki67是由分子量為345 kD和395 kD的兩條多肽鏈組成的核蛋白。Ki67在有絲分裂后期迅速降解或失去抗原決定簇，優(yōu)于目前常用的增殖細胞核抗原(PCNA)，被認為是可靠而全面地反映細胞群體增殖活性的客觀指標(biāo)［7］。在癌前病變階段，長期持續(xù)的Hp感染可促進Ki67的過度表達，其中的推測理由是幽門螺桿菌釋放的脂多糖、尿素酶、空泡毒素與黏附素等重要的毒性致病因子刺激上皮細胞受體，宿主會出現(xiàn)生長抑素分泌紊亂、炎性介質(zhì)釋放、氧自由基形成、上皮細胞增殖與凋亡失衡、癌基因與抑癌基因突變等改變。在本研究中，Ki67在食管癌中明顯表達，且與Hp感染成相關(guān)性。Ki67在新疆維族中陽性率較高，表明新疆食管癌增殖能力較強，破壞性較大，危害性更嚴(yán)重。

MMP2是MMPs家族中重要的一員，是降解基底膜成分Ⅳ型膠原纖維的主要酶。在癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用［8］。在本研究中，MMP2在食管癌中表達明顯，且與Hp感染成相關(guān)性。MMP2在新疆維族中陽性率極高，表明新疆食管癌具有較強的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

Hp感染不僅能誘導(dǎo)上皮細胞增殖，同時也可誘導(dǎo)其侵襲和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致上皮細胞增殖和凋亡的異常增加，使細胞具備了向惡性方向轉(zhuǎn)化的條件。其機制可能與Hp感染后引起的炎癥反應(yīng)及釋放炎癥介質(zhì)有關(guān)，這些因素一方面引起細胞損傷致使細胞增殖加快而增生活躍的細胞，其DNA合成旺盛，易受基因毒致癌物質(zhì)的損傷，因而易發(fā)生基因的不穩(wěn)而癌變，而增殖過度若超過凋亡速度時，使增殖與凋亡之間失衡，導(dǎo)致了食管癌的形成。另一方面炎癥時組織內(nèi)中性粒細胞及單核細胞等炎性細胞大量浸潤，這些炎性細胞在炎癥刺激下尚可合成具有高度反應(yīng)活性的氮氧化物，繼而再形成N-亞硝基化合物及硝酸鹽和亞硝酸鹽等致癌物質(zhì)，進一步導(dǎo)致DNA的損傷和細胞凋亡，而腫瘤細胞本身持續(xù)性釋放NO也可促進腫瘤細胞的生長［9］。本實驗中，食管癌組Hp、Ki67和MMP2表達明顯高于正常對照組，與多數(shù)研究結(jié)果一致［8，10，11］。在食管鱗狀細胞癌中，Ki67和MMP2的表達相應(yīng)增高，提示Hp的感染與腫瘤增殖和侵襲惡性程度相關(guān)。

［1］Sarah B Umar，David E Fleischer.Esophageal cancer:epidemi ology，pathogenesis and prevention ［J］.NatClin Pract Gastroenterol Hepatol，2008，5(9):517-526.

［2］馬燕花，吳 靜，嚴(yán) 祥，等.食管癌中白細胞-DR抗原表達與幽門螺桿菌感染［J］.中國公共衛(wèi)生，2005，21(10):1207-1208.

［3］于東紅，周 蕾，郭冰沁，等.MMP-2、Ki67在食管癌中的表達及與腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移的關(guān)系［J］.蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005，30(5):383-385.

［4］Kapral M，Wawszczyk J，Jurzak M，et al.Evaluation of the expres sion of metalloproteinases 2 and 9 and their tissue inhibitors in colon cancer cells treated with phytic acid［J］.Acta Pol Pharm，2010，67(6):625-629.

［5］Ye W，Held M，Lagergren J，et al.Helicobacter pylori infection and gastric atrophy:risk ofadenocarcinoma and squamous-cell carcinoma of the esophagus and adenocarcinoma of the gastric cardia［J］.J Natl Cancer Inst，2004，96(5):388-396.

［6］薛 越，劉長林，李 聞，等.新疆寒冷地區(qū)哈薩克族農(nóng)牧民幽門螺桿菌感染流行病學(xué)調(diào)查［J］.中華流行病學(xué)雜志，2007，28(8):826-827.

［7］Igarashi N ，Takahashi M，Ohkubo H，et al.Predictive value of Ki-67，p53 protein，and DNA content in the diagnosis of gastric carcinoma［J］.Cancer，1999，86(8):1449-1454.

［8］林秋雄，曾仁海，蔡秀玲，等.基質(zhì)金屬蛋白酶 MMP-2和MMP-9在食管癌組織中的表達意義［J］.腫瘤防治雜志，2002，9(3):271-272.

［9］Tari A，Kodama K，Kurihara K，et al.Does serum nitrite concentration reflect gastric carcinogenesis in Japanse Helicobacter pyloriinfected patients［J］.Dig Dis Sci，2002，47:100-106.

［10］徐黎明，袁秋雁，李 薇.胃粘膜Ki-67表達與Hp感染及癌變的關(guān)系探討［J］.浙江臨床醫(yī)學(xué)，2007，9(5):603-604.

［11］Szachnowicz S，Cecconello I，Iriya K，et al.Origin of adenocarcinoma in Barrett's esophagus:p53 and Ki67 expression and histopathologic background［J］.Clinics，2005，60(2):103-112.