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    食蟹猴實驗感染HBV的血清學(xué)反應(yīng)①

    2014-11-27 10:26:12王振常梁增文黃晶晶陳松林廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院南寧530023
    中國免疫學(xué)雜志 2014年6期
    關(guān)鍵詞:食蟹靈長類動物模型

    王振常 梁增文 冷 靜 韋 毅 黃晶晶 陳松林(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,南寧530023)

    HBV感染呈世界性流行,據(jù)統(tǒng)計我國人群中HBsAg陽性率平均為7.18%(中國廣西地區(qū)屬高流行區(qū):HBsAg陽性率高達10%,10年來乙肝報告發(fā)病率呈顯著的逐年增高趨勢)[1,2],每年全世界約有100萬人、我國約有30萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細胞癌等相關(guān)性肝病。HBV感染已成為全球面臨的嚴(yán)重公共健康問題之一,面臨的防治形勢十分嚴(yán)峻。

    乙肝表面抗原(HBsAg)疫苗接種對HBV感染有很好的預(yù)防作用,但有部分接種者無應(yīng)答;臨床上抗病毒藥物能有效控制病毒復(fù)制,但需要長期服藥,面臨著患者產(chǎn)生耐藥性、治療無應(yīng)答、不良反應(yīng)嚴(yán)重等問題[3],此外,對肝臟病變本身還沒有有效的治療方法。造成這一局面的主要原因是由于沒有能進行HBV自然感染且能反映臨床乙肝發(fā)生、發(fā)展過程的理想動物模型,導(dǎo)致目前對HBV感染的致病機制和肝臟病變的發(fā)展及轉(zhuǎn)歸認(rèn)識還很不全面和深入。本實驗旨在報道食蟹猴對HBV攻毒后的血清學(xué)反應(yīng),為該動物模型的研究提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 動物 實驗室內(nèi)人工繁育的1~3日齡或成年食蟹猴各12只(防城港常春生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供)觀察1個月經(jīng)病毒學(xué)篩選證實為健康動物后,各隨機分為對照組(6只)、感染組(6只),感染組食蟹猴接種HBV攜帶者血清0.5 ml(HBV-DNA≥108拷貝)單只籠養(yǎng)。對照組注射HBsAg陰性正常血清 0.5 ml。

    1.2 方法 各組從接種后1~12周每日觀察行為變化,每1周取血樣檢測HBV-M、HBV-DNA、肝功能及于對于HBsAg陽性食蟹猴在B超引導(dǎo)下取肝組織常規(guī)HE染色檢測肝組織炎癥程度。

    檢測方法:(1)HBV-M用化學(xué)發(fā)光法檢測,試劑購自安圖;(2)采用實時熒光定量PCR檢測HBV-DNA的濃度,試劑購自上海浩源生物工程公司;(3)ALT、AST的檢測采用日立7600全自動分析儀及其配套試劑檢測。

    2 結(jié)果

    2.1 一般狀態(tài) 攻毒后至ALT、AST出現(xiàn)應(yīng)答的食蟹猴出現(xiàn)輕度倦臥,大便溏爛,小便黃,全部實驗持續(xù)進行3個月,未見死亡動物。

    2.2 血清學(xué)檢查

    2.2.1 HBV-M的應(yīng)答及HBV-DNA結(jié)果 見表1。如表所示成年猴接種后未引發(fā)HBsAg陽性反應(yīng),有3只幼年猴出現(xiàn)HBsAg、HBcAb(按檢測例次統(tǒng)計陽性率為50%)及2只出現(xiàn)HBV-DNA反應(yīng)(按檢測例次統(tǒng)計陽性率為33.33%)。

    2.2.2 ALT、AST反應(yīng) ALT在攻毒出現(xiàn)HBsAg陽性后1周開始升高,1個月后達到高峰,其值為180 U/L,以后漸降,持續(xù)1個月后接近正常。AST 1周后高于正常參考值(60 U/L)呈低平曲線,高峰較ALT遲1個月。兩者升高值約為正常參考值的2~6倍。

    2.3 肝組織病理學(xué)結(jié)果 見圖1。圖2為正常肝組織的HE染色結(jié)果。HE染色可見部分肝組織呈輕微肝炎病變,肝細胞呈氣球樣變,部分區(qū)域有點狀壞死,小葉界板尚完整,基本與人類乙型肝炎病理改變相似。

    表1 食蟹猴HBV-M、HBV-DNA的檢測結(jié)果(時間:周)Tab.1 Detection result of HBV-M and HBV-DNA to cynomolgus monkeys(time:week)

    圖1 病變肝組織Fig.1 Tissue of resions

    圖2 正常肝組織Fig.2 Tissue of normal liver

    3 討論

    目前已知的5種病毒性肝炎動物模型均已建立。非人類的靈長類動物(黑猩猩、長臂猿等)可以感染HBV,且感染的HBV基因型與感染人類的基本一樣[4],其感染HBV后的血清學(xué)和肝臟病理組織學(xué)改變與人較接近。因其來源受限,其疾病程度比人要輕得多,無法作為肝硬化及肝癌的研究模型;進一步又尋求長臂猿、食蟹猴、熊猴、紅面猴等動物進行實驗感染HBV,將為乙肝動物模型的研究帶來新的希望[5]。國內(nèi)學(xué)者用樹鼩和板鴨作為乙肝的動物模型取得較大進展,但也有不足之處[5]。

    曾經(jīng)認(rèn)為除黑猩猩之外,尚無其他非人靈長類動物可作為理想的乙肝動物模型,但關(guān)于猴乙肝病毒感染動物模型國內(nèi)外卻有少數(shù)成功建模的報道。

    食蟹猴(Macaca fascicularis)又稱長尾獼猴,屬于哺乳綱靈長目獼猴屬,是目前國內(nèi)外使用量最大的非人靈長類實驗動物。其生物進化程度高,無論是在生理學(xué)、遺傳學(xué)還是生物學(xué)特性上與人類都極相似,與人類的遺傳物質(zhì)有75.0%~98.5%的同源性。根據(jù)調(diào)查,中國是世界上少數(shù)幾個非人靈長類動物資源豐富的國家之一,是目前世界上最大的實驗猴出口國,國內(nèi)外醫(yī)學(xué)實驗中常用的猴子有恒河猴和食蟹猴,這兩種猴子也是中國目前人工馴養(yǎng)繁育靈長類動物的主要品種。廣西實驗食蟹猴的存欄量和生產(chǎn)量均居全國首位,成功建立全國最大的食蟹猴飼養(yǎng)繁育基地,并開始投入人力、物力建立食蟹猴重大疾病模型的研究。由于實驗動物資源和其他原因的限制,國內(nèi)外關(guān)于食蟹猴乙型肝炎動物模型的研究目前仍屬空白。

    國內(nèi)學(xué)者葛憲民等[6]于1987~1990年進行了3種猴(熊猴、紅面猴、獺猴)實驗感染HBV后的歷時12周動態(tài)肝活檢組織觀察,證實了猴乙型肝炎動物模型的成功建立。張濤等通過60Co全身照射處理大量殺傷機體的造血細胞和免疫細胞后(歷時12周),可以明顯地提高恒河猴對HBV的敏感性,有異于以往學(xué)者認(rèn)為HBV感染恒河猴后無生化及肝組織學(xué)改變的觀點[7]。研究認(rèn)為恒河猴可以作為一種研究HBV感染的動物模型,感染后可在血清中檢測到HBsAg,但濃度較低,其敏感性低于黑猩猩。如前研究已證實了類人猿、黑猩猩、猴等高等非人靈長類動物建立乙型肝炎動物實驗?zāi)P偷目尚行浴?/p>

    我們研究食蟹猴感染HBV后的血清學(xué)反應(yīng),旨在探索動物模型的建立。雖至今無成熟的報道,但從本文近來的血清反應(yīng)結(jié)果顯示出新的苗頭。首先,用含HBV-DNA的人血清攻毒后幼年食蟹猴陸續(xù)出現(xiàn)HBsAg陽性率為 50.0%(3/6),HBcAb陽性率為50.0%(3/6),同時檢出 HBV-DNA 為16.67%(2/6),ALT 1周后反應(yīng)性升高,1個月后達高峰,持續(xù)近1個月漸復(fù)常,AST較ALT高峰晚1個月,其峰值達正常參考值的2~6倍。肝組織HE染色可見部分肝組織呈輕微肝炎病變,肝細胞呈氣球樣變,部分區(qū)域有點狀壞死,小葉界板尚完整,基本與人類乙型肝炎病理改變相似(見圖2)。幼年食蟹猴感染HBV后,血清中很快出現(xiàn)抗HBe抗體及HBs抗體,HBsAg快速消失,肝組織學(xué)反應(yīng)與人急性肝炎過程相仿,這一點和人的急性自限性肝炎很相似,有可能用來研究HBV感染、HBV感染過程中宿主的免疫反應(yīng)。

    但從實驗猴的一般情況來分析攻毒后僅個別實驗猴出現(xiàn)稍微疲倦、大便溏爛等不適癥狀,但未見實驗動物死亡,與其他動物實驗研究文獻報道的多點、大量攻毒后出現(xiàn)如食欲下降、豎毛、精神萎靡、易激惹、甚至部分實驗動物出現(xiàn)死亡等嚴(yán)重反應(yīng)明顯偏輕[8],這說明我們可在加大攻毒量、多點注射部位及攻毒后免疫調(diào)節(jié)等方面優(yōu)化實驗方法,并利用更理想、專門的檢測試劑,可能會提高實驗成功率及結(jié)果的敏感性,本文研究為初步結(jié)果,實驗尚在繼續(xù)完善中。

    [1]梁曉峰,陳園生,王曉軍,等.中國3歲以上人群乙型肝炎血清學(xué)流行病學(xué)研究[J].中華流行病學(xué)雜志,2005,26(9):347-351.

    [2]沈立萍,楊進業(yè),莫兆軍,等.廣西壯族自治區(qū)1996-2005年乙型肝炎發(fā)病狀況監(jiān)測分析[J].疾病控制雜志,2007,11(2):210-211.

    [3]Mailliard ME,Gollan JL.Emerging therapeutics for chronic hepatitis B[J].Annu Rev Med,2006,57:155-166.

    [4]Kamili S,Sozzi V,Thompson G,et al.Efficacy of hepatitis B vaccine against antivirial dru-resistant hepatitis B virus mutants in the chimpanzee model[J].Hepatology,2009,49(5):1483-1491.

    [5]魏泓主編.醫(yī)學(xué)實驗動物學(xué)[M].成都:四川科技出版社,1998:347-346.

    [6]葛憲民,黃果勇,王樹聲.猴的人HBV實驗感染的現(xiàn)代病理學(xué)研究[J].廣西預(yù)防醫(yī)學(xué),1996,2(4):226-228.

    [7]張 濤,王樹聲,黃果勇,等.獼猴感染人乙肝病毒動物模型病理學(xué)研究[J].廣西預(yù)防醫(yī)學(xué),2001,7(1):12-15.

    [8]趙素元,黃 星,鄒 林,等.灰旱獺實驗感染HBV的血清學(xué)反應(yīng)[J].中國實驗動物學(xué)雜志,2002,12(2):80-81.

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