糖類抗原19-9單抗制備及DAS-ELISA的建立①

王云龍 翟晉豫 王繼創(chuàng) 程 蕾 李玉林 葛新杰 毛 烈

(河南師范大學生命科學學院，新鄉(xiāng) 453007)

1979 年 Koprowski等［1］以結腸癌細胞 株SW1116作為免疫原，獲得了多種特異性的單克隆抗體。其中經(jīng)單克隆抗體1116-NS19-9特異性識別的抗原被命名為糖類抗原19-9(Carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)。CA19-9是一種類黏蛋白形式的糖蛋白。同時也是多種癌癥檢測的重要參考指標之一［2-4］。研究表明，CA19-9針對胰腺癌、胃癌等有著良好的特異性及敏感性，針對胰腺癌相關檢測陽性率可以達到80%［5］。因此，建立CA19-9的檢測對于癌癥的臨床診斷具有重大意義。

作為CA19-9檢測試劑盒的重要組成部分，特異性的CA19-9單克隆抗體的制備顯得至關重要。但目前國內(nèi)試劑盒所采用的CA19-9單克隆抗體多為國外公司生產(chǎn)，少數(shù)國內(nèi)生產(chǎn)的單克隆產(chǎn)品在特異性、穩(wěn)定性等方面尚有許多不足［6］，這嚴重影響了國產(chǎn)試劑盒的品質(zhì)。本研究旨在探索利用新型免疫佐劑結合半固體培養(yǎng)法克隆化陽性雜交瘤細胞對單克隆抗體制備的意義，并利用制備獲得的單抗建立雙抗體夾心ELISA(DAS-ELISA)方法，以此提升國產(chǎn)檢測試劑盒的性能。

1 材料與方法

1.1 主要材料 CA19-9抗原購于Fitzgerald Industries International公司。33份病患血清來自鄭州大學第一附屬醫(yī)院。Quick Antibody免疫佐劑購于北京康碧泉生物科技有限公司。8周齡左右雌性BALB/c小鼠購自鄭州大學醫(yī)學院實驗動物中心。SP2/0小鼠骨髓瘤細胞為本實驗室保存。PEG4000、HAT、HT、RPMI1640 培養(yǎng)基均購于 Gibco公司。辣根過氧化物酶(HRP)購于Sigma公司。HRP-兔抗鼠IgG由本實驗室制備。蛋白質(zhì)Marker購于上海生工生物公司。小鼠亞型鑒定試劑盒為鄭州百基生物科技有限公司產(chǎn)品。CA19-9 ELISA檢測試劑盒為德國Roche公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 抗原免疫 免疫小鼠分為2組:A組將Quick Antibody佐劑與抗原等體積混勻，選取3只BALB/c雌性小鼠作為一組。另取1只小鼠注射等體積PBS溶液作為陰性對照。初次抗原免疫劑量為25 μg/只。2周后進行2次免疫，免疫劑量為25 μg/只。第3周采集尾血進行效價檢測。B組:采用弗氏免疫佐劑進行常規(guī)免疫，小鼠數(shù)目同A組?？乖庖邉┝繛?00 μg/只。1只對照小鼠注射等體積PBS溶液。共免疫3次，間隔周期為2周。A組免疫方式為肌肉注射，B組采用背部多點結合腹腔注射。7 d后采集小鼠尾血，測定血清效價。

1.2.2 間接ELISA檢測法的建立 利用棋盤篩選法進行操作?？乖♂尦?0.25、0.5、0.75、0.1、0.15、0.2 μg/ml濃度，37℃包被 2 h，洗滌，以含 1%BSA的PBST封閉。小鼠血清1 000倍稀釋加樣，溫育30 min。洗滌、拍干。將酶標 IgG稀釋至1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000、1∶10 000倍加入，溫育30 min，洗滌、拍干。加入TMB顯色，2 mol/L的硫酸終止，測定光吸收(OD)值。以陰性小鼠血清作為對照，設計3個復孔平行，依照P/N值最大確立最佳的抗原包被濃度及對應的酶標稀釋濃度。

1.2.3 阻斷ELISA法測定抗體的敏感性 CA19-9抗原按照0.5 μg/ml進行包被與封閉。同時將抗原進行倍比稀釋，與經(jīng)檢測OD值接近1.0左右的小鼠稀釋血清50 μl等體積混合，同時設空白與陰性對照。設計3平行復孔，利用間接法檢測計算OD均值。以光吸收值在0.500左右、抗原濃度較低一組的小鼠作為融合備用小鼠。

1.2.4 細胞融合及單克隆抗體篩選 融合前調(diào)整SP2/0骨髓瘤細胞至對數(shù)生長期，選擇CA19-9小鼠血清抗體效價、敏感性高的小鼠作為融合用鼠進行細胞融合操作。收集SP2/0細胞，制備免疫小鼠脾臟細胞懸液。分別計數(shù)后，以1∶10的比例混勻，37℃條件下利用50%PEG4000進行促融。融合細胞用濃度為5 μg/ml的 HAT篩選培養(yǎng)基混勻，以2.0×106個 /ml密度鋪在含飼養(yǎng)層的96孔板中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)至第3日半換液，第9日全部換液，利用間接ELISA法檢測培養(yǎng)孔中有無抗體分泌。

借鑒本實驗室任瑞敏等［7］文獻中半固體瓊脂克隆化篩選方法，利用RPMI1640配制1.1%的甲基纖維素培養(yǎng)基，并加入2.5 mmol/L L-谷氨酰胺、20%胎牛血清、1∶1 000青霉素-鏈霉素溶液混勻，取上述檢測陽性孔中細胞重懸至該半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待有肉眼可見細胞集落出現(xiàn)，利用毛細管克隆化陽性雜交瘤細胞。

1.2.5 小鼠腹水抗體效價檢測及亞型鑒定 小鼠腹腔注入陽性雜交瘤細胞收集腹水，利用間接ELISA測定該腹水效價，并采用辛酸硫酸銨法純化腹水抗體，紫外分光光度法測量OD值，并計算蛋白濃度。利用鼠亞型鑒定試劑盒對單克隆抗體進行亞型鑒定。

1.2.6 篩選配對抗體 采用改良過碘酸鈉法將辣根過氧化物酶與單克隆抗體耦聯(lián)后，以病患血清為待測樣本，1 μg/ml包被3種單克隆抗體。加入1∶10稀釋定值病患血清后再加入1∶2 000倍稀釋的上述酶標抗體形成DAS-檢測方法，設計3平行復孔取OD均值，分析配對結果。

1.2.7 DAS-ELISA法的建立與特異性測定 利用棋盤法建立DAS-ELISA，包被抗體濃度分別取0.5、0.75、1、1.25、1.5、2 μg/ml進行包被。酶標抗體分別按照 1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000、1∶10 000進行稀釋，二者依照DAS-ELISA 60 min-60 min-20 min反應模式進行。選取經(jīng)賦值為1.0左右的陽性稀釋血清，以正常人血清在0.10左右為陰性，依據(jù)檢測結果，以陽性檢測結果值接近1.0，陰性對照低為最佳包被與酶標稀釋濃度。

利用上步構建的DAS-ELISA法對本實驗室已有的CEA、CA12-5、CA15-3高值特異性血清進行檢測，判斷有無交叉反應。

1.2.8 標準曲線的繪制 利用建立的DAS-ELISA檢測方法，選擇多濃度水平的定值病患血清作為檢測樣本，OD值為縱坐標，血清CA19-9抗原濃度為橫坐標，繪制標準曲線，判斷線性范圍。

1.2.9 DAS-ELISA法的應用 利用獲取的33份病患血清，通過本實驗構建的DAS-ELISA檢測方法與國外試劑盒進行對比檢測，比較二者相關性。

2 結果

2.1 間接ELISA檢測方法的確立 由棋盤法確定了抗原包被濃度為0.5 μg/ml，HRP-羊抗鼠IgG稀釋濃度為1∶6 000作為檢測的最優(yōu)組合。

2.2 免疫效果對比及抗血清效價檢測 評價效果以陰性OD值2.1倍以上(不足0.05按0.05)判斷為能夠檢測到的效價水平。效價結果表明:A組2、3號小鼠與B組1、3號小鼠的效價度均達到1.28×106，其余2只小鼠的效價為3.2×104。A、B組免疫效果小鼠血清效價檢測值近似，說明Quick Antibody佐劑在節(jié)省抗原的基礎上，也能達到較高的抗體水平，見表1。

表1 小鼠抗血清效價檢測Tab.1 Determination titer of mice antiserum

2.3 多克隆抗體敏感性的檢測 多克隆抗體敏感性檢測結果如圖1所示。結果顯示，A組2、3號小鼠和B組1、3號小鼠的IC50值在0.16～ 0.63 μg/ml之間，抑制效果較好，產(chǎn)生多克隆抗體的敏感性值較高，此類小鼠適合作為融合小鼠。

2.4 細胞融合率及篩選得到陽性雜交瘤細胞 細胞融合進行了3次。經(jīng)觀察克隆團形成孔統(tǒng)計數(shù)目，分別計算得出細胞融合的融合率為88.3%、83.9%和91.2%。通過對細胞克隆化上清間接ELISA法檢測，共獲得了7株可分泌抗體的陽性細胞株，2株后期轉陰，其余5株細胞株分別命名為ZJY1-2C8、ZJY2-3H9、ZJY2-7F10、ZJY3-4B6、ZJY3-1G9。后經(jīng)細胞傳代穩(wěn)定性等鑒定，最終確定3株較好 細 胞 株，分 別 為 ZJY1-2C8、ZJY2-7F10、ZJY3-1G9。

2.5 腹水效價檢測與單克隆抗體的純化及濃度測定 經(jīng)間接ELISA法檢測，3株抗體的腹水效價均達到了106左右。經(jīng)SDS-PAGE電泳，觀察到2條大小約為25 kD與55 kD的明顯條帶(如圖2)。單克隆抗體ZJY1-2C8的蛋白濃度約為14.7 mg/ml，ZJY2-7F10約為 17.1 mg/ml，ZJY3-1G9約為 12.8 mg/ml。

2.6 單克隆抗體亞型鑒定 利用小鼠亞型鑒定試劑盒對3株單克隆抗體進行亞型鑒定，結果:3株mAb均為IgG1型單克隆抗體。

2.7 配對抗體的篩選 篩選方法采用DAS-ELISA檢測方法，設計正交實驗，結果如表2所示。結果顯示:以ZJY3-1G9作為包被抗體、ZJY2-7F10作為酶標抗體時，測得的病患血清OD數(shù)值最高，說明兩者之間所識別的抗原表位不同，且距離稍遠，適合進一步實驗需要。

2.8 建立DAS-ELISA檢測法 利用棋盤法，將ZJY3-1G9作為包被抗體、ZJY2-7F10作為酶標抗體，檢測結果如表3。結果分析:當包被在1 μg/ml，酶標稀釋濃度為1∶6 000時，陽性值在1.0左右，陰性對照OD值為0.134較低，此包被與酶標為最佳。DAS-ELISA法檢測CEA、CA12-5、CA15-3均無交叉反應，證明配對抗體特異性較好。

圖1 小鼠多克隆抗體敏感性檢測結果Fig.1 Detection results from mouse polyclonal antibody reflects on sensitivities

表2 篩選配對抗體結果Tab.2 Results of antibody pairing test

表3 確定包被濃度及酶標抗體稀釋濃度Tab.3 Determination coating concentration of mAb and dilution of mAb-HRP

2.9 線性方程及范圍 經(jīng)不同賦值的定值血清利用上步結果檢測出一系列OD值并做曲線。由圖4可見，抗原濃度在30～300 U/ml范圍中呈現(xiàn)線性關系，取此抗原濃度與對應OD值確定回歸方程:y=0.006 3x+0.069 7，R2=0.989 5。通過對樣品稀釋液進行20次重復檢測，依據(jù)均值±2SD值，確定最低檢測線為:26.4 U/ml。

2.10 DAS-ELISA檢測方法與國外試劑盒對比驗證

利用構建的DAS-ELISA檢測法與國外購買的試劑盒同時檢測33份病患血清，結果如圖3所示。在本實驗室條件下建立的DAS-ELISA檢測方法與國外試劑盒檢測對比結果顯示，兩者相關性良好，r=0.950 4，回歸方程:y=0.911 1x+2.076，R2=0.903 2。

3 討論

圖2 純化后抗體蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.2 Results of SDS-PAGE with purified protein

圖3 CA19-9標準曲線Fig.3 Standard curve of CA19-9

圖4 DAS-ELISA檢測方法與國外試劑盒對比驗證結果Fig.4 Results of DAS-ELISA compared with Kits

眾多研究已表明:CA19-9是能夠針對胰腺癌、胃癌、宮頸癌等疾病診斷的一項腫瘤標記物［8-10］。目前臨床及研究使用的診斷試劑盒多為德國Roche、美國雅培等公司產(chǎn)品，國內(nèi)生產(chǎn)試劑盒并不多見［11］。盧培等［12］利用兩株單克隆抗體配對進行光激化學發(fā)光免疫分析方法來探索應用與臨床的可行性，燕強奮［6］建立雙位點夾心免疫放射分析法來與法國CIS公司對比，相關系數(shù)r=0.896。前者雖選用的是國產(chǎn)單克隆抗體，但是未對其品質(zhì)進行評價。后者選用國外單克隆抗體基本滿足了免疫分析要求，但效果并未凸顯。因此，獲得一對優(yōu)異的配對抗體對提升CA19-9抗原的檢測水平，提升試劑盒品質(zhì)至關重要。

本實驗應用新型免疫佐劑Quick Antibody對比常規(guī)免疫佐劑，縮短免疫周期，節(jié)省抗原使用量。同時配合使用半固體培養(yǎng)基法縮短獲取單克隆抗體時間［7］，在較高融合率保證的基礎下，最終獲得3株較好單克隆抗體，經(jīng)配對實驗，建立完成DAS-ELISA檢測方法。在與國外試劑盒的檢測對比結果顯示相關系數(shù)r=0.950 4，具有良好相關性。但因?qū)嶒灤郎y樣本量少，對結果會有一定影響，后期實驗主要需大量檢測樣本評價此方法的各方面性能指標。本實驗在提升CA19-9檢測試劑盒品質(zhì)方面具有實際意義。

［1］Koprowski H，Steplewski Z，Mitchell K，et al.Colorectal carcinoma antigens detected by hybridoma antibodies［J］.Somatic Cell Genet，1979，5(6):957-971.

［2］華建江，陳 望，姜健等.可溶性B7-H4在早期胃癌中的診斷價值探討［J］.中國免疫學雜志，2012，28(8):745-747.

［3］Humphris JL，Chang DK，Johns AL，et al.The prognostic and predictive value of serum CA19-9 in pancreatic cancer［J］.Annals Oncol，2012，23(7):1713-1722.

［4］Viola-Villegas NT，Rice SL，Sean Carlin，et al.Applying PET to broaden the diagnostic utility of the clinically validated CA19-9 serum biomarker for oncology［J］.J Nucl Med，2013，54(11):1876-1882.

［5］倪曉光，趙 平，王貴齊.血清腫瘤標志物CA19-9在胰腺癌診斷和預后中的價值［J］.臨床和實驗醫(yī)學雜志，2008，7(5):14-15.

［6］燕強奮，陳永利，王衍真.CA19-9雙位點夾心免疫放射分析法的建立［J］.同位素，2007，20(1):16-19.

［7］任瑞敏，王云龍，張怡青，等.利用改良后的脾內(nèi)免疫和半固體培養(yǎng)基法制備單克隆抗體［J］.生物技術通報，2013，8:166-169.

［8］劉玉榮，王 艷，趙雪梅，等.CA199、CA242對胰腺癌的診斷價值探討［J］.中國實用醫(yī)藥，2013，8(14):118-119.

［9］李 曦，李 偉.CA199表達升高在良惡性疾病中的意義［J］.中國實用醫(yī)藥，2013，8(24):3-4.

［10］楊馥彥，黃江玲，邱少雄，等.CA125和CA199與CEA聯(lián)合檢測診斷卵巢癌的價值［J］.中國校醫(yī)，2013，27(5):339-340.

［11］羅 玥.CA125、CA199在子宮內(nèi)膜異位癥診斷中的應用價值［J］.中國婦幼保健，2013，28:1690-1691.

［12］盧 培，趙衛(wèi)國，黃秋芳.糖類抗原CA19-9光激化學發(fā)光免疫分析方法的建立［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2012，22(2):260-263.