氟西汀在實驗性自身免疫性腦脊髓炎中的保護作用研究①

張 宇 王貴泉 張美妮(山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，太原 030001)

多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)是具有軸突損害的一類脫髓鞘性疾病，實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)為其經(jīng)典的動物模型。很多研究者更多研究小膠質(zhì)細胞，認為其在MS發(fā)病中起主要作用，而近年來，星形膠質(zhì)細胞在免疫性疾病中的病理生理作用得到了更多關(guān)注?；罨男切文z質(zhì)細胞產(chǎn)生各種促炎細胞因子和趨化因子，作為直接或間接的免疫介質(zhì)或炎癥介質(zhì)參與MS病理改變。LCN2是一種脂質(zhì)運載蛋白，以自分泌和旁分泌的方式由星形膠質(zhì)細胞分泌，LCN2與星形膠質(zhì)細胞膜上的受體結(jié)合，激活JAK2，使STAT3發(fā)生磷酸化，促進CXCL10的生成和星形膠質(zhì)細胞的活化［1］，最終導致脫髓鞘和軸索損害。氟西汀是一種選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(Selective serotonin reuptake inhibitors，SSRI)，本研究通過觀察LCN2、CXCL10在 EAE中的變化，探討氟西汀的可能保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 近交系清潔級8～10周大小健康雌性C57BL/6小鼠80只，體質(zhì)量18～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。實驗小鼠隨機分為對照組(健康小鼠)、EAE組、接受紫外線照射模型組(干預組)及氟西汀組。每組均20只。

1.1.2 主要藥品與試劑 完全弗氏佐劑(CFA)、髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白(Myelin oligodendrocyte glycoprotein-35-55，MOG35-55)、兔多克隆抗-LCN2 抗體、生物素化山羊抗兔IgG均購自武漢博士德公司;百日咳毒素購自美國Sigma公司;氟西汀(百憂解)生產(chǎn)廠為Patheon France，分包裝廠為禮來蘇州制藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 紫外線照射［2］紫外線照射2 d前剪除各組小鼠頭背部毛發(fā)，剪除面積約3 cm×3 cm。紫外線照射波長在280～320 nm。紫外線光源距小鼠頭背部無毛發(fā)區(qū)約20 cm，照射時間為30 s。照射儀器采用Waldmann公司生產(chǎn)的峰值為311 nm窄譜中波紫外線光療儀(TL01)，照射劑量為2 J/cm2，累積照射劑量為60 J/cm2。為了更充分的接受紫外線照射，每只小鼠被放進帶有8個隔斷的籠子里分別進行照射。對照組和EAE組小鼠僅剪除頭背部毛發(fā)，不進行紫外線照射。

1.2.2 動物模型的建立、治療及神經(jīng)功能評分 紫外線照射后1 h［3］，EAE組、干預組及氟西汀組建立EAE動物模型，對照組為健康小鼠。EAE模型制作過程:用生理鹽水將MOG35-55稀釋成終濃度為3 mg/ml，然后將稀釋液與等體積的完全弗氏佐劑混合，用玻璃注射器抽吸成油包水狀，制成誘導乳劑。按0.2 ml/只給予模型組及干預組C57BL/6小鼠背部中央偏頭側(cè)皮下4點注射誘導乳劑，于免疫后第0天、第2天分別進行腹腔注射百日咳毒素400 ng。致敏當天記為第0天［4］。對照組用生理鹽水+CFA代替誘導乳劑。

于模型動物免疫第1天開始并連續(xù)給予氟西汀組小鼠氟西汀(10 mg/kg)灌胃;EAE組、對照組和干預組同樣于該組動物免疫第1天開始連續(xù)給予生理鹽水(0.2 ml/d)灌胃，均持續(xù)至實驗結(jié)束。每天稱體質(zhì)量，觀察動物行為，并進行神經(jīng)功能評分。

臨床癥狀評分分5級:正?；驘o任何神經(jīng)缺損癥狀，計為0分;尾部肌張力消失，可見輕度步態(tài)笨拙，計為1分;尾部無力，雙后肢肌張力低，計為2分;尾部無力，雙后肢癱瘓，但給予刺激后可挪動，計為3分;癱瘓累及前肢，伴尿便失禁，計為4分;瀕死狀態(tài)或死亡，計為5分。癥狀介于兩標準之間以±0.5分計。動物出現(xiàn)臨床癥狀即可以認為發(fā)病。照射紫外線過程中2只死亡小鼠退出實驗。小鼠數(shù)量不足按相同方法補足。

1.2.3 組織學觀察(1)取材:連續(xù)觀察60 d后，各組隨機抽取6只小鼠腦組織放入4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛中固定、石蠟包埋、切片。(2)采用HE染色及免疫組織化學染色(具體步驟參見說明書)，在Aperio ScanScope掃描儀下分別觀察各組腦組織中炎性細胞浸潤程度和陽性細胞的分布并計數(shù)。免疫組化一抗為兔多克隆抗-LCN2抗體，二抗為生物素化山羊抗兔IgG。一抗稀釋濃度為1∶100。

1.2.4 標本采集和CXCL10水平的檢測 各組于觀察結(jié)束后均隨機抽取10只小鼠全血，靜置30 min后離心(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司生產(chǎn)的KDC-40低速離心機，轉(zhuǎn)速:3 000 r/min，離心10 min)，留取每只小鼠血清標本約0.3 ml，保存于－80℃冰箱備用。用酶聯(lián)免疫吸附法測定各組小鼠血清CXCL10水平，操作嚴格按照試劑盒說明進行。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0軟件進行分析。計量資料均采用表示。組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，率的比較采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀 EAE組小鼠在免疫后第13～15天發(fā)病，免疫后第20～23天發(fā)病達高峰，免疫后第28～30天進入慢性期。氟西汀組小鼠臨床癥狀較同期EAE組小鼠明顯改善。干預組平均發(fā)病時間(22.59±1.121)d，氟西汀組為(42.55±1.508)d，短于氟西汀組(P＜0.05);隨觀察時間延長，小鼠臨床癥狀逐漸加重，氟西汀組發(fā)病高峰期神經(jīng)功能評分(2.273±1.272)低于干預組(3.176±1.015)及EAE組(4.200±0.447)(P＜0.05)，干預組低于EAE組(P＜0.05)。EAE組小鼠全部發(fā)病，氟西汀組小鼠發(fā)病率(55%)明顯低于干預組(85%)和EAE組(100%)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 實驗小鼠神經(jīng)功能評分變化Fig.1 Variance of nerve function grades of experimental mice

2.2 腦組織病理表現(xiàn)

2.2.1 Aperio ScanScope掃描儀下觀察HE染色EAE組小鼠腦組織伴有明顯的炎性細胞浸潤現(xiàn)象，在腦組織主要集中在軟膜下和腦室周圍白質(zhì)。EAE組小鼠腦組織中可見血管袖套現(xiàn)象和明顯的腦膜炎表現(xiàn)，以單核細胞浸潤為主;干預組、氟西汀組中炎性細胞浸潤現(xiàn)象明顯減少，炎性細胞浸潤呈散在性，血管袖套現(xiàn)象消失。隨觀察時間延長，慢性期小鼠腦組織中可見顯著的白質(zhì)疏松，巨噬細胞和多形核細胞浸潤，見圖2。

圖2 實驗小鼠腦中病理表現(xiàn)Fig.2 Representation of brain in experimental mice

2.2.2 腦組織中LCN2的表達情況 各組均有陽性細胞存在，EAE組白質(zhì)空泡形成、疏松明顯，EAE組(57.33±3.670)、氟西汀組(48.00±5.899)和干預組(49.33±5.785)陽性細胞數(shù)平均秩次明顯高于對照組(13.00±3.742)，且具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。氟西汀組和干預組陽性細胞數(shù)較EAE組明顯減少(P＜0.05)。氟西汀組陽性細胞數(shù)較干預組無明顯變化(P＞0.05)，見圖3。

圖3 實驗小鼠腦組織中LCN2的表達Fig.3 Expression of LCN2 in brain of experimental mice

2.3 C57BL/6小鼠血清CXCL10含量測定 CXCL10含量EAE組高于氟西汀組，氟西汀組高于對照組(P＜0.05)，見表1。

2.4 EAE組60 d小鼠腦組織中LCN2陽性細胞數(shù)平均秩次和血清CXCL10含量相關(guān)性分析 EAE組小鼠腦組織中LCN2陽性細胞數(shù)平均秩次和血清CXCL10含量之間的相關(guān)系數(shù)為0.939，雙尾檢驗的概率值為0.005(P＜0.01)，結(jié)果顯示二者存在顯著的線性相關(guān)，見圖4。

表1 實驗小鼠外周血清中CXCL10的表達()Tab.1 Expression of CXCL10 in the peripheral blood plasma of experimental mice()

表1 實驗小鼠外周血清中CXCL10的表達()Tab.1 Expression of CXCL10 in the peripheral blood plasma of experimental mice()

Note:1)P ＜0.05，vs control group;2)P ＜0.05，vs fluoxetine group;P ＞0.05，vs intervention group;3)P ＜0.05，vs intervention group.

Groups CXCL10 Fluoxetine group 83.69±12.001)3)Intervention group 95.92±10.601)EAE group 97.74±17.641)2)Control group 69.77±12.46

圖4 EAE小鼠腦組織LCN2陽性細胞數(shù)與血清CXCL10水平相關(guān)性分析Fig.4 Correlation between LCN2 immunopositive cells in brain and CXCL10levelinbloodplasmaof EAE mice

3 討論

MS的病因和發(fā)病機制尚不清楚。免疫炎癥反應在EAE的發(fā)病中起到重要作用，星形膠質(zhì)細胞作為腦內(nèi)的免疫效應細胞，促進CNS發(fā)生固有免疫應答和適應性免疫應答［5］，參與MS的發(fā)病。LCN2是一個疏水性分子的結(jié)合蛋白，也稱作24P3。Lee等［6］研究證實在 CNS，LCN2以自分泌的方式由星形膠質(zhì)細胞生成，作用是促進細胞形態(tài)學的改變和細胞的遷移。Lee等［1］采用DNA微陣列分析方法進一步研究發(fā)現(xiàn)LCN2誘導STAT3肽鏈的絲氨酸和絡氨酸進行磷酸化修飾，促進小鼠腦組織中CXCL10的生成，最終導致CNS炎性反應和損傷。因此，LCN2在MS和EAE的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

通過本實驗研究發(fā)現(xiàn)，EAE小鼠病程上表現(xiàn)為急性發(fā)作，而非緩解的慢性過程;但可見動物存在部分臨床表現(xiàn)恢復現(xiàn)象，與顏津津等［7］報道一致。在HE染色中，EAE小鼠腦組織中伴有大量的炎性細胞浸潤，免疫組化結(jié)果顯示LCN2陽性細胞數(shù)較對照組明顯升高，且具有統(tǒng)計學意義，表明LCN2表達的增加與EAE的發(fā)展有關(guān)。EAE組小鼠LCN2陽性細胞數(shù)與 CXCL10水平的相關(guān)性分析，證實LCN2、CXCL10不僅參與EAE的發(fā)病，而且CXCL10表達的增高與LCN2的分泌有關(guān)。

在不同種系小鼠和不同造模方法前提下，紫外線的作用是不同的。故本實驗采用紫外線照射小鼠，進一步觀察其對C57BL/6小鼠的作用。本實驗結(jié)果顯示，干預組小鼠臨床癥狀較EAE組改善，具有統(tǒng)計學意義。組織病理學結(jié)果顯示炎性細胞浸潤現(xiàn)象減少，LCN2陽性細胞數(shù)較EAE組減少，有統(tǒng)計學意義，說明紫外線照射可以在臨床癥狀和組織病理學表現(xiàn)方面減輕EAE的發(fā)病。但是血清學指標結(jié)果顯示干預組與EAE組CXCL10表達水平無統(tǒng)計學意義，推測可能是由于紫外線的照射更多的作用于C57BL/6小鼠外周血中其他更敏感的因子，相對而言對CXCL10的影響不大;還有可能是實驗小鼠CNS中CXCL10的表達較外周血中更敏感，在CNS該因子降低的幅度較EAE組更明顯，更有可能得出有統(tǒng)計學意義。但是本實驗中沒有更好的反應出來。

氟西汀是一種選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑，其可通過增加CNS突觸間隙中5-羥色胺的濃度而調(diào)節(jié)免疫功能，發(fā)揮髓鞘保護作用［8］，還有可能抑制核因子-κB的激活，減少T細胞的激活和炎性因子表達，如腫瘤壞死因子-α和干擾素-γ，還能通過促進cAMP效應元件的磷酸化的激活，增加腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達［9-11］。本研究結(jié)果顯示，氟西汀組臨床癥狀明顯改善，發(fā)病高峰期神經(jīng)功能評分較EAE組、干預組降低，且具有統(tǒng)計學意義;HE染色炎性浸潤減少，CXCL10水平較EAE組、干預組明顯減少，具有統(tǒng)計學意義，免疫組化結(jié)果顯示氟西汀組與干預組LCN2陽性細胞數(shù)無統(tǒng)計學意義，但氟西汀組、干預組均與EAE組有統(tǒng)計學意義，說明氟西汀對EAE的保護作用較紫外線照射更明顯，證明氟西汀可緩解 EAE進展，與減少 LCN2的分泌有關(guān)。

綜上所述，LCN2、CXCL10與EAE發(fā)病有關(guān)，氟西汀可緩解EAE發(fā)生、發(fā)展，為臨床治療MS提供了新的思路和實驗依據(jù)。

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