不同類型音樂(lè)對(duì)老年大鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響①

何 穎 李淑梅 馬洪喜(長(zhǎng)春大學(xué)音樂(lè)學(xué)院，長(zhǎng)春 130022)

音樂(lè)可以鼓舞精神和激活大腦，引起強(qiáng)烈的快感和內(nèi)在獎(jiǎng)賞系統(tǒng)的假定刺激，這表明音樂(lè)的存在有利于精神和軀體的健康［1，2］。近年來(lái)越來(lái)越多的人開(kāi)始關(guān)注音樂(lè)對(duì)健康的影響，發(fā)現(xiàn)彈奏、聆聽(tīng)和創(chuàng)作音樂(lè)幾乎能夠影響每個(gè)認(rèn)知功能，因此音樂(lè)提供了研究神經(jīng)系統(tǒng)科學(xué)眾多方面的一個(gè)工具［3］。本實(shí)驗(yàn)在聆聽(tīng)音樂(lè)方面，通過(guò)音樂(lè)刺激老年大鼠，檢測(cè)血清、腦組織Caspase-3和Livin的水平，從神經(jīng)細(xì)胞凋亡方面探討不同類型音樂(lè)對(duì)大鼠神經(jīng)系統(tǒng)的作用機(jī)制為音樂(lè)治療的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑 健康老年雄性Wistar大鼠40只，20月齡，體重(360±20)g，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(動(dòng)物許可證號(hào):SCXK2007-吉大-0003);ELISA試劑盒購(gòu)于南京建成生物有限公司;兔抗鼠Caspase-3和Livin一抗購(gòu)于北京博奧森生物有限公司，SP和DAB試劑盒購(gòu)于福州邁新生物有限公司;實(shí)時(shí)-PCR試劑購(gòu)于塔克拉生物試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及實(shí)驗(yàn)方法 健康老年雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為4組:空白對(duì)照組10只、莫扎特音樂(lè)組10只、梁祝音樂(lè)組10只和搖滾音樂(lè)組10只。每天上午水迷宮訓(xùn)練同時(shí)音樂(lè)干預(yù)2 h，下午單純音樂(lè)干預(yù)2 h，音樂(lè)強(qiáng)度為65～85分貝連續(xù)7 d，第8天處死大鼠取血液及腦組織，待測(cè)試。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 血清及腦組織海馬區(qū)中Caspase-3和Livin蛋白含量的檢測(cè) 采用ELISA法，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.2 腦組織海馬區(qū)中Caspase-3和Livin蛋白陽(yáng)性表達(dá)的檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)，取腦組織固定于福爾馬林液中，包埋，切片4微米，60℃烤箱烘片4 h，然后脫蠟至梯度酒精至水洗，抗體稀釋液濃度均為1∶300，其余步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，DAB顯色后，用蘇木精復(fù)染，封片。采用Motic Image Advanced 3.2圖像分析儀，行半定量分析檢測(cè)灰度值，陽(yáng)性表達(dá)越高灰度值越低，陽(yáng)性表達(dá)越低灰度值越高。

1.3.3 腦組織海馬區(qū)中Caspase-3和Livin基因水平的檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)，Caspase-3上游引物:5'-TGGAACAAATGGACCTGTTG-3'，下游引物:5'-AGGACTCAAATTCTGTTGCC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物256 bp;Livin上游引物:5'-TCCACAGTGTGCAGGAGACT-3'，下游引物:5'-ACGGCACAAAGACGATGGAC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物368 bp;β-actin上游引物:5'-CCTAAGGCCTAACCGTCGAA-3'，下游引物:5'-GGATGCCTAGGGCAGTAATC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物 168 bp。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 血清及腦組織中Caspase-3和Livin的蛋白含量、蛋白表達(dá)灰度值及基因變化水平，其實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

各組大鼠一般狀態(tài)均好，皮毛光滑、精神飽滿。

2.1 血清及腦組織海馬區(qū)中Caspase-3和Livin蛋白含量的比較 與對(duì)照組比較，莫扎特音樂(lè)組、梁祝音樂(lè)組大鼠血清及腦組織海馬區(qū)中Caspase-3蛋白含量降低、Livin蛋白含量升高均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，莫扎特音樂(lè)組和梁祝音樂(lè)組之間比較無(wú)顯著差異(P＞0.05);而搖滾音樂(lè)組大鼠血清及腦組織海馬區(qū)中Caspase-3和Livin蛋白含量均無(wú)明顯改變(P ＞0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 腦組織海馬區(qū)中Caspase-3和Livin蛋白陽(yáng)性強(qiáng)度的比較 與對(duì)照組比較，莫扎特音樂(lè)組、梁祝音樂(lè)組大鼠腦組織海馬區(qū)中Caspase-3蛋白陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度降低、Livin蛋白陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度升高均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，莫扎特音樂(lè)組和梁祝音樂(lè)組之間比較無(wú)顯著差異(P＞0.05);而搖滾音樂(lè)組大鼠腦組織海馬區(qū)中Caspase-3和Livin蛋白陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度均無(wú)明顯改變(P ＞0.05)，見(jiàn)表2，圖1、2。

2.3 腦組織海馬區(qū)中Caspase-3和Livin基因水平的比較 與對(duì)照組比較，莫扎特音樂(lè)組、梁祝音樂(lè)組大鼠腦組織海馬區(qū)中Caspase-3基因水平降低、Livin蛋白基因水平升高均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，莫扎特音樂(lè)組和梁祝音樂(lè)組之間無(wú)顯著差異(P＞0.05);而搖滾音樂(lè)組大鼠腦組織海馬區(qū)中Caspase-3和Livin基因水平均無(wú)明顯改變(P＞0.05)，見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠血清、腦組織海馬區(qū)中Caspase-3和Livin蛋白含量的比較(n=10，)Tab.1 Comparision of Caspase-3 and Livin protein contents in serum and hippocampus of brain tissue(n=10，)

表1 各組大鼠血清、腦組織海馬區(qū)中Caspase-3和Livin蛋白含量的比較(n=10，)Tab.1 Comparision of Caspase-3 and Livin protein contents in serum and hippocampus of brain tissue(n=10，)

Note:Compared with control group，1)P ＜0.01.

Groups Serum(ng/ml)Brain tissue(ng/ml)Caspase-3 Livin 5±0.93 1.03 Mozart music 2.31±0.651)9.51±0.841)3.48±0.751)10.78±0.971)Liangzhu music 2.42±0.491)9.39±0.721)3.53±0.691)10.63±1.121)Rock music 3.09±0.84 8.24±0.68 4.22±0.57 9.4 Caspase-3 Livin Control 3.16±0.52 8.11±0.63 4.33±0.78 9.34±

表2 各組大鼠腦組織海馬區(qū)中Caspase－3和Livin蛋白陽(yáng)性強(qiáng)度(灰度值)及基因水平的比較(n=10，)Tab.2 Comparision of Caspase-3，Livin protein levels(grey value)and real-time PCR in hippocampus of brain tissue(n=10，)

表2 各組大鼠腦組織海馬區(qū)中Caspase－3和Livin蛋白陽(yáng)性強(qiáng)度(灰度值)及基因水平的比較(n=10，)Tab.2 Comparision of Caspase-3，Livin protein levels(grey value)and real-time PCR in hippocampus of brain tissue(n=10，)

Note:Compared with control group，1)P ＜0.01.

Groups Protein levels(grey value)mRNA Caspase-3 Livin Control 113.24±4.18 110.56±5.24 5.21±0.76 1 Caspase-3 Livin 2 10.22±1.01 0.13±0.98 Mozart music 140.45±5.021)90.15±3.911)4.43±0.611)11.37±1.061)Liangzhu music 136.28±4.671)90.59±4.661)4.55±0.591)11.14±0.881)Rock music 116.53±4.16 116.41±4.72 5.14±0.8

圖1 腦組織海馬區(qū)中Caspase-3的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×400)Fig.1 Caspase-3 expression in hippocampus of brain tissue(Immunohistochemical staining，×400)

圖2 腦組織海馬區(qū)中Livin的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×400)Fig.2 Livin expression in hippocampus of brain tissue(Immunohistochemical staining，×400)

3 討論

音樂(lè)訓(xùn)練可減少因老齡化而造成的記憶力下降，青少年時(shí)期學(xué)過(guò)音樂(lè)的人，老了后在記憶和認(rèn)知能力方面的測(cè)試要推遲十年老化［4］。老年人進(jìn)行持續(xù)的音樂(lè)活動(dòng)可提高思維能力，消除因年齡甚至因缺乏教育而帶來(lái)的負(fù)面影響，在這項(xiàng)研究中70名59～80歲的音樂(lè)家和非音樂(lè)家進(jìn)行了神經(jīng)心理測(cè)驗(yàn)和調(diào)查，在心理測(cè)試、視覺(jué)空間的判斷、言語(yǔ)記憶、回憶和機(jī)動(dòng)靈活性方面，音樂(lè)家得分更高［5］。感知和處理音樂(lè)并不是后來(lái)才加到我們的認(rèn)識(shí)上的，而是已經(jīng)在我們周圍很久，從我們神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)展的最初階段就存在的了［6］。音樂(lè)有一個(gè)生物學(xué)基礎(chǔ)，而且大腦對(duì)音樂(lè)有一個(gè)功能組織，許多大腦區(qū)域參與了音樂(lè)處理過(guò)程的特殊方面，無(wú)論是對(duì)基本的感知還是喚起的情感反應(yīng)，音樂(lè)家似乎具有額外的專門化作用，尤其是對(duì)一些大腦結(jié)構(gòu)的超發(fā)展，這些效應(yīng)表明了，音樂(lè)學(xué)習(xí)調(diào)節(jié)了大腦，增加了個(gè)體細(xì)胞的應(yīng)答和細(xì)胞的數(shù)目［7］。國(guó)內(nèi)外的研究表明特定的音樂(lè)對(duì)放松身心、振作精神、誘發(fā)睡眠等有實(shí)效，能提高機(jī)體學(xué)習(xí)記憶能力，能夠提高機(jī)體抗疲勞、抗衰老及調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫機(jī)能，隨著對(duì)音樂(lè)和大腦研究的繼續(xù)，本實(shí)驗(yàn)參照國(guó)內(nèi)外大鼠相關(guān)研究，采用音樂(lè)強(qiáng)度65～85分貝干預(yù)，研究音樂(lè)干預(yù)在神經(jīng)系統(tǒng)方面的調(diào)節(jié)機(jī)制［8-10］。

Caspase-3與Livin是神經(jīng)系統(tǒng)中重要的損傷與抗損傷因子。Caspase-3能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞正常死亡;而Livin的表達(dá)能夠抗細(xì)胞凋亡。Caspase家族是直接導(dǎo)致凋亡細(xì)胞解體的蛋白酶系統(tǒng)，在細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制網(wǎng)絡(luò)中居中心地位。可作用于一些其他的Caspase家族成員，并降解凋亡細(xì)胞中的某些成分，導(dǎo)致蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)放大，最終使細(xì)胞凋亡［11］。因此Caspase-3被稱為死亡蛋白酶，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶。大量實(shí)驗(yàn)證明，如果在Caspase-3激活之前進(jìn)行干預(yù)，可以有效抑制凋亡的發(fā)生［12］。近年用形態(tài)學(xué)或生化的方法均證實(shí)，衰老的腦組織神經(jīng)元細(xì)胞具有典型的凋亡特征;其凋亡與Caspase-3的激活有關(guān)，Caspase-3的表達(dá)水平可作為衡量神經(jīng)元損傷的客觀指標(biāo)，其中海馬組織較皮層組織可能更為敏感。Livin是一類分子水平的抗細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子，它能夠鈍化宿主對(duì)感染的自殺反應(yīng)，有學(xué)者證明，Livin能夠直接抑制Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9 酶水解作用，可能阻止Caspases蛋白在細(xì)胞凋亡時(shí)執(zhí)行蛋白切除功能;Livin可引起Caspases蛋白的降解，還能通過(guò)抑制Caspases的活性途徑抗凋亡作用［13，14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，莫扎特音樂(lè)組、梁祝音樂(lè)組大鼠血清及腦組織中Caspase-3蛋白含量、蛋白表達(dá)和基因水平均較對(duì)照組降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，Livin蛋白含量、蛋白表達(dá)和基因水平均升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，莫扎特音樂(lè)組略好于梁祝音樂(lè)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而搖滾音樂(lè)組大鼠血清及腦組織中Caspase-3和Livin蛋白含量、蛋白表達(dá)和基因水平均較對(duì)照組無(wú)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);提示:音樂(lè)干預(yù)可通過(guò)下調(diào)Caspase-3、上調(diào)Livin水平，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用，這一結(jié)果也為音樂(lè)治療選擇背景音樂(lè)方面提供了理論依據(jù)。

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