橋本甲狀腺炎患者殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體與人類白細(xì)胞抗原基因?qū)︻l率的分析①

李建婷 郭 成 侯巖峰 焦玉蓮 趙躍然 孫 慧 徐 進(jìn) 曹銘鋒 高 聆 趙家軍 張海清 李明龍(山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院內(nèi)分泌科，濟(jì)南250021)

殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(Killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR)主要表達(dá)于自然殺傷細(xì)胞(Natural killer，NK)和部分T細(xì)胞表面，通過特異性識(shí)別靶細(xì)胞表面人類白細(xì)胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)，調(diào)控NK細(xì)胞和T細(xì)胞的免疫活性。HLA-C屬于經(jīng)典的HLA-I類分子，廣泛分布于有核細(xì)胞表面，根據(jù)第80位氨基酸的不同，可將HLA-C分為HLA-C1(Asn80)和HLA-C2(Lys80)兩組。HLA-C1組包括 HLA-Cw01、Cw03、Cw07、Cw08，特異性識(shí)別 KIR2DL2/3和 KIR2DS2;HLA-C2 組包括 HLA-Cw02、Cw04、Cw05、Cw06，特異性識(shí)別KIR2DL1和KIR2DS1。兩組HLA-C配體分別與不同的KIR受體結(jié)合，影響機(jī)體自身的免疫穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致疾病的發(fā)生［1-3］。

橋本甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis，HT)是自身免疫甲狀腺病的一種，其發(fā)病機(jī)制可能與HT患者體內(nèi)NK細(xì)胞和T細(xì)胞的免疫功能紊亂有關(guān)，但是具體機(jī)制尚未完全闡明。本研究旨在以往研究的基礎(chǔ)上，用序列特異性引物PCR(sequence specific primer polymerase chain reaction，PCR-SSP)方法進(jìn)一步分析KIR/HLA受體配體基因?qū)Φ姆植技捌渑cHT發(fā)病間的關(guān)聯(lián)性。

1 材料與方法

1.1 試劑與引物 Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司，dNTP購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)［4，5］，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 研究對(duì)象的選擇 HT組選擇2012年10月至2013年3月就診于山東省立醫(yī)院的山東地區(qū)橋本甲狀腺炎患者44例，其中男1例，女43例，患者全部存在彌漫性甲狀腺腫大，實(shí)驗(yàn)室檢查見甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)和甲狀腺球蛋白抗體(TgAb)明顯升高，甲狀腺B超示符合橋本甲狀腺炎表現(xiàn)，甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果確診為HT，并排除其他甲狀腺及自身免疫性疾病。對(duì)照組為同期同地區(qū)無血緣關(guān)系的隨機(jī)健康個(gè)體43例，其中男1例，女42例，均排除甲狀腺疾病、自身免疫性疾病及相關(guān)家族病病史。HT患者組與對(duì)照組的年齡、性別分布經(jīng)檢驗(yàn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.3 基因組DNA提取 空腹抽取外周靜脈血，ACD抗凝，用氯仿、飽和酚法提取DNA。

1.4 KIR基因分型分析 用序列特異性引物PCR方法進(jìn)行KIR基因分型。測(cè)定的KIR基因包括抑制性 KIR:KIR2DL1、KIR2DL2/3，活化性 KIR:KIR2DS1、KIR2DS2以及框架基因 KIR2DL4。PCR反應(yīng)體系20 μl，其中模板 DNA 100 ng，上、下游引物終濃度 0.2 μmol/L，10 × PCR buffer 2 μl，MgCl21.6 mmol/L，dNTP 0.25 mmol/L，Taq DNA 聚合酶0.5 U，加 ddH2O 至20 μl。反應(yīng)條件:96℃預(yù)變性 1 min，循環(huán)參數(shù):96℃ 變性 25 s，65℃ 退火 45 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行5個(gè)循環(huán);96℃變性25 s，60℃退火45 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行21 個(gè)循環(huán);96℃變性 25 s，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，進(jìn)行5個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Alpha Imager TM2200生物圖像分析儀分析結(jié)果。每一個(gè)DNA模板的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以框架基因KIR2DL4作為PCR反應(yīng)效率的內(nèi)參照。

1.5 HLA-C基因分型分析 用序列特異性引物PCR方法進(jìn)行HLA-C基因分型。測(cè)定的HLA-C基因?yàn)?HLA-Cw01-Cw08。PCR 反應(yīng)體系20 μl，其中模板 DNA 100 ng，上下游引物終濃度 0.5 μmol/L，2 ×PCR buffer 10 μl，dNTP 0.25 mmol/L，Taq DNA 聚合酶 0.5 U，加 ddH2O 至 20 μl。反應(yīng)條件:96℃預(yù)變性7 min，循環(huán)參數(shù):96℃變性 30 s，68℃退火 45 s，72℃延伸60 s，進(jìn)行 5個(gè)循環(huán);96℃變性 30 s，63℃退火45 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行21個(gè)循環(huán);96℃變性30 s，55℃退火 1 min，72℃ 延伸 2 min，進(jìn)行 5 個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物處理同上。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0軟件包處理，患者組與對(duì)照組之間KIR/HLA-C基因?qū)︻l率顯著性差異采用四格表卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KIR/HLA-C基因?qū)︻l率在兩組間的比較 分別比較HT患者組和健康對(duì)照組KIR2DL1+HLAC2、KIR2DL2/3+HLA-C1、KIR2DS1+HLA-C2 和KIR2DS2+HLA-C1四對(duì)KIR/HLA-C基因?qū)Φ念l率(圖1)，四對(duì)基因?qū)圆煌l率表達(dá)，與對(duì)照組相比，HT患者組外周血中KIR2DS2+HLA-C1基因?qū)︻l率顯著升高(36.36%vs 16.28%，P ＜0.05)，其余3對(duì)基因?qū)?KIR2DL1+HLA-C2、KIR2DL2/3+HLA-C1和KIR2DS1+HLA-C2在HT組和對(duì)照組頻率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 各HLA-C基因頻率在兩組間的比較 分別比較 HLA-C1(HLA-Cw02、04、05、06)和 HLA-C2(HLA-Cw01、03、07、08)兩組 HLA-C 基因，兩組HLA-C基因在外周血中呈不平衡表達(dá)，其中HLACw03和HLA-Cw08基因在HT患者中頻率較健康對(duì)照者減低，兩組相比差異有顯著性(15.91%vs 40.70%，26.14%vs 47.67%，P 均 ＜0.05)。但是總的HLA-C1和HLA-C2頻率在兩組間無顯著性差異(表1)。

圖1 4對(duì)基因?qū)υ趦山M人群中頻率的差異性比較Fig.1 Frequencies of four KIR/HLA-C gene-pairs in HT patients in comparison with healthy controls

表1HLA-C1和HLA-C2基因頻率比較Tab.1 Frequencies of HLA-C1 and HLA-C2 genes in patients compared with control subjects

3 討論

近年來，關(guān)于KIR基因與疾病間關(guān)系的研究屢見不鮮，越來越多證據(jù)表明，特定的KIR基因型在腫瘤、病毒感染、妊娠流產(chǎn)及自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［6-9］。根據(jù)我們之前的研究，KIR多態(tài)性與HT的發(fā)病相關(guān)，其中抑制性KIR基因KIR2DL5可能是HT發(fā)病的保護(hù)因子［10］。但是隨著研究的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)在判斷KIR生物學(xué)效應(yīng)時(shí)，應(yīng)同時(shí)分析其與HLA配體的配對(duì)情況，KIR只有通過與特異性HLA配體結(jié)合才能發(fā)揮對(duì)NK細(xì)胞和T細(xì)胞免疫活性的調(diào)節(jié)作用。例如，單獨(dú)分析KIR頻率時(shí)，黑色素瘤患者和1型糖尿病患者的KIR頻率與正常人群相似;而分析KIR受體與HLA配體基因?qū)r(shí)，發(fā)現(xiàn)黑色素瘤患者的抑制性KIR/HLA-C基因?qū)︻l率較正常人群低［11］，1型糖尿病患者活化性基因?qū)︻l率較正常人群高［12］。到目前為止，國(guó)內(nèi)外有關(guān)HT患者KIR與HLA受體配體基因?qū)Φ难芯旷r有報(bào)道，因此，我們?cè)谝酝芯康幕A(chǔ)上，又延伸了對(duì)HT患者和健康對(duì)照人群KIR/HLAC受體配體基因?qū)︻l率差別的研究。

我們應(yīng)用PCR-SSP方法分析兩組人群間4對(duì)不同KIR/HLA-C基因?qū)︻l率的差別，結(jié)果顯示只有活化性KIR2DS2/HLA-C1基因?qū)︻l率在兩組人群中有顯著性差異，并且HT患者頻率明顯高于健康人群(36.36%vs 16.28%，P ＜ 0.05)，雖然 HLACw03和HLA-Cw08在兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是總體HLA-C1和HLA-C2頻率并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，不能作為判定HLA-C基因有意義的標(biāo)準(zhǔn)。以往Faridi等［8］應(yīng)用PCR-SSP方法研究了早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的KIR和HLA基因組合，發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者KIR2DL1/HLA-C2基因頻率低于正常早孕婦女，而活化性KIR2DS2/HLA-C1基因頻率則明顯高于患者，表明抑制性和活化性KIR/HLA-C基因均可能與習(xí)慣性流產(chǎn)的發(fā)生有關(guān)。國(guó)內(nèi)徐金娥等［13］做了類似的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有活化性KIR2DS2/HLA-C1基因?qū)︻l率在兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且患者組頻率高于對(duì)照組。Yen等［9］用同樣的方法對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者做了研究，發(fā)現(xiàn)患者KIR2DS2/HLA-C1基因?qū)︻l率較健康對(duì)照者高。HT、習(xí)慣性流產(chǎn)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生均與自身免疫功能異常相關(guān)，以上研究結(jié)果均提示抑制性和(或)活化性KIR/HLA-C基因?qū)赡茉谧陨砻庖咝约膊〉陌l(fā)病中起作用。

對(duì)健康人而言，抑制性KIR/HLA受配體對(duì)可避免機(jī)體發(fā)生自身免疫性疾病，因此，抑制性受配體基因?qū)λ急壤胶馐蔷S持機(jī)體免疫狀態(tài)的重要條件，而活化性KIR/HLA受配體對(duì)主要增強(qiáng)機(jī)體免疫功能以抵抗病原體的入侵，但是它的活化作用往往異常，這又可能成為自身免疫性疾病的易感因素［14］。NK細(xì)胞和T細(xì)胞是機(jī)體重要的具有免疫功能的細(xì)胞，表達(dá)在NK細(xì)胞和部分T細(xì)胞表面的KIR受體，通過與特異性 HLA-C類分子結(jié)合，向NK/T細(xì)胞傳遞活化性或抑制性信號(hào)，調(diào)節(jié)NK/T細(xì)胞功能［15］。正常情況下，活化性受體和抑制性受體傳遞的兩種信號(hào)總和平衡，使得NK/T細(xì)胞功能穩(wěn)定，可耐受自身正常細(xì)胞［16，17］。如果活化性 KIR/HLA-C組合頻率超過了抑制性受配體組合頻率，NK/T細(xì)胞接受的活化性信號(hào)就多于抑制性信號(hào)，對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用就強(qiáng)，有可能對(duì)機(jī)體正常組織細(xì)胞進(jìn)行攻擊。相反，如果抑制性信號(hào)多于活化性信號(hào)，NK/T細(xì)胞的殺傷作用就會(huì)相對(duì)較弱，損傷靶細(xì)胞的能力相對(duì)減低，不會(huì)對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞造成損傷［18］。

本研究結(jié)果顯示，與健康人群相比，HT患者外周血活化性KIR2DS2/HLA-C1基因?qū)︻l率增加，可能通過影響活化性與抑制性KIR/HLA-C受配體對(duì)之間的平衡，使NK/T細(xì)胞的激活閾值下降，易于被自身抗原激活，破壞機(jī)體的免疫穩(wěn)定狀態(tài)，異常激活的NK/T細(xì)胞可直接殺傷自身甲狀腺細(xì)胞造成甲狀腺組織過度破壞，導(dǎo)致HT相關(guān)臨床癥狀的發(fā)生。現(xiàn)已證實(shí)，CD4+輔助性 T細(xì)胞(T helper，Th)的Th1型細(xì)胞因子介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在HT發(fā)病中起主導(dǎo)作用［19，20］，異常激活的 NK/T細(xì)胞也可分泌 TNF-α、IFN-γ等Th1細(xì)胞因子從而間接誘導(dǎo)甲狀腺細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致自身甲狀腺組織破壞，致使HT的發(fā)生。

綜上所述，HT患者外周血中KIR2DS2/HLA-C1基因?qū)︻l率增高，使NK/T細(xì)胞功能異常導(dǎo)致機(jī)體自身免疫功能紊亂，可能是引起HT發(fā)病的免疫遺傳學(xué)因素之一。對(duì)KIR/HLA-C基因?qū)Φ姆治鰹檠芯縃T的發(fā)病機(jī)制提供了新的方法，為今后橋本甲狀腺炎的早期診斷早期治療開辟新的思路。但是有關(guān)KIR、HLA-C基因在mRNA、蛋白等表達(dá)水平的研究仍不完善，有待今后進(jìn)一步深入的研究。

［1］Ho PY，Barton A，Worthington J，et al.HLA-Cw6 and HLADRB1* 07 together are associated with less severe joint disease in psoriatic arthritis［J］.Ann Rheum Dis，2007，66(6):807-811.

［2］Kano T，Mori T，F(xiàn)urudono M，et al.Human leukocyte antigen may predict outcome of primary recurrent spontaneous abortion treated with paternal lymphocyte alloimmunization therapy［J］.Am J Reprod Immunol，2007，58(4):383-387.

［3］Parham P.MHC class I molecules and KIRs in human history，health and survival［J］.Nat Rev Immunol，2005;5(3):201-214.

［4］Martin MP，Nelson G，Lee JH，et al.Cutting edge:susceptibility to psoriatic arthritis:influence of activating killer Ig-like receptor genes in the absence of specific HLA-C alleles［J］.J Immunol，2002，169(6):2818-2822.

［5］Bunce M，O’Neill CM，Barnardo MC，et al.Phototyping:comprehensive DNA typing for HLA2A，B，C，DRB1，DRB3，DRB4，DRB5 and DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing sequence-specific primers(PCR-SSP)［J］.Tissue Antigens，1995，46(5):355-367.

［6］MacDonald KP，Kuns RD，Rowe V，et al.Effector and regulatory T-cell function is differentially regulated by RelB with antigenpresenting cells during GVHD［J］.Blood，2007，109(11):5049-5057.

［7］Khakoo SI，Thio CL，Martin MP.HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolveng hapatitis C virus infection［J］.Science，2004，305(5685):872-874.

［8］Faridi RM，Agrawal S.Killer immunoglobulin-like receptors(KIRs)and HLA-C allorecognition patterns implicative of dominant activation of natural killer cells contribute to recurrent miscarriages［J］.Hum Reprod，2011，26(2):491-497.

［9］Yen JH，Moore BE，Nakajima T，et al.Major histocompatibility complex class I-recognizing receptors are disease risk genes in rheumatoid arthritis［J］.J ExpMed，2001，193(10):1159-1167.

［10］張海清，趙家軍，趙躍然，et al.橋本甲狀腺炎患者殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體基因多態(tài)性分析［J］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2008，28(5):454-457.

［11］Naumova E，Mihaylova A，Stoitchkov K，et al.Genetic polymorphism of NK receptors and their ligands in melanoma patients:prevalence of inhibitory over activating signals［J］.Cancer Immunol Immunother，2005，54(2):172-178.

［12］Vaner Slik AR，Koeleman BP，Verduijn W，et al.KIR in type 1 diabetes:disparate distribution of activating and inhibitory natural killer cell receptors in patients versus HLA-matched control subjects［J］.Diabetes，2003，52(10):2639-2642.

［13］徐金娥，楊曉菊，張 云，等.殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體及其配體HLA-C基因多態(tài)性與不明原因早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2010，5(26):420-424.

［14］Smita K，Martin MP，Carrington M.The Yin and Yang of HLA and KIR in human disease［J］.Semin Immunol，2008，20(6):343-352.

［15］Vilches C，Parham P.KIR:diverse，rapidly evolving receptors of innate and adaptive immunity［J］.Annu Rev Immunol，2002，20:217-251.

［16］Joncker NT，Raulet DH.Regulation of NK cell responsiveness to achieve self-tolerance and maximal responses to diseased target cells［J］.Immunol Rev，2008，224:85-97.

［17］MacFarlane AWt 4th，Campbell KS.Signal transduction in natural killer cells［J］.Curr Top Microbiol Immunol，2006，298:23-57.

［18］賴艷麗，曹祥山，吳 強(qiáng)，等.免疫球蛋白樣抑制性受體KIR基因與HLA-Cw的匹配對(duì)NK細(xì)胞活性的影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2009，17(3):637-642.

［19］Yu S，Sharp GC，Braley-Mullen H.Thyrocytes responding to INF-gamma are essential for development of lymphocytic spontaneous autoimmune thyroiditis and inhibition of thyrocyte hyperplasia［J］.J Immunol，2006，176(2):1259-1265.

［20］Nanba T，Watanabe M，Inoue N，et al.Increases of the Th1/Th2 cell ratio in severe Hashimoto’s disease and in the proportion of Th17 cells in intractable Graves'disease［J］.Thyroid，2009，19(5):495-501.