中藥組方 NDRF對佐劑性關(guān)節(jié)炎家兔滑膜 MMP-3、VEGF分子及其mRNA的影響①

談益芬 唐艷麗 王勝香 郭錦錦 李 均 孫萬邦

(遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)/貴州省免疫學研究生教育創(chuàng)新基地，珠海519041)

類風濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的自身免疫性疾病，病因尚不清楚，其主要病變部位在關(guān)節(jié)滑膜，滑膜細胞類腫瘤樣增生、炎性細胞浸潤、新生血管生成，進而形成血管翳，造成關(guān)節(jié)的畸形和功能的喪失[1，2]。近年來有研究提示血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-3(Matrix metalloproteinase-3，MMP-3)在RA滑膜炎癥、血管新生、血管翳的形成及軟骨與骨的破壞這一系列過程中可能起到關(guān)鍵性作用。中藥組方NDRF是由羌活(Notopterygium incisium Ting)、獨活(Doubleteeth pubescent angelica root)、防 風 (Radix sileris)和 木 瓜 (Fructus chaenomelis)為主藥，共由14味藥組成，主要藥理作用為祛風除濕、補氣溫陽活血，本組方在臨床治療RA患者具有較好的療效，但缺乏理論依據(jù)，為探討NDRF治療機制并指導臨床應用，本課題組采用此組方及聯(lián)合甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)對家兔佐劑性關(guān)節(jié)炎(Adjuvant arthritis，AA)動物模型進行實驗性治療。前期研究表明弗氏佐劑聯(lián)合TNF-α改良方法造模能提高家兔AA模型成模率，中藥組方NDRF及聯(lián)合MTX能改善AA家兔滑膜組織病理損害，抑制IL-6、IL-8的表達作用[3]。本文通過檢測治療后家兔滑膜組織 MMP-3、VEGF細胞因子及其mRNA的變化，探討其藥物作用及機制，為中藥NDRF組方及聯(lián)合治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑 清潔級新西蘭白兔50只，雌雄各半，體重為(2.30±0.50)kg，由遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)實驗動物中心提供;弗氏完全佐劑(Complete freund adjuvant，CFA)Sigma公司產(chǎn)品;8%硫化鈉脫毛劑(Na2S)，本室配制;腫瘤壞死因子(TNF-α)上海近岸蛋白質(zhì)科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 實驗藥物 甲氨蝶呤由廣東嶺南制藥有限公司提供;中藥NDRF組方由羌活、獨活、防風和木瓜為主藥，包括白芍、威靈仙、伸筋草、白芷、茯苓、土茯苓、丹參、千斤拔、桑枝和川斷等14味藥組成，由遵義醫(yī)學院第五附屬醫(yī)院李均博士提供。

1.3 試劑盒及主要儀器 MMP-3、VEGF ELISA檢測試劑盒為上海江萊生物制藥有限公司產(chǎn)品，酶標儀(ELx-800)為美國Bio-Tek公司產(chǎn)品，ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品，凝膠圖像分析系統(tǒng)為PC gene公司產(chǎn)品。

1.4 佐劑性關(guān)節(jié)炎的誘導及治療方案 新西蘭白兔適應性喂養(yǎng)1周后，足爪剃毛，稱體重，在伸直體位測膝關(guān)節(jié)周徑，采用隨機抓取的方法分為正常組(8只)和造模組(42只)，按文獻[3]的方法造模及進行治療。

1.5 采集滑膜液及滑膜組織標本 家兔處死后立即于膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)分別注射無菌生理鹽水0.3 ml，無菌手術(shù)打開關(guān)節(jié)腔，抽取關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑膜液0.3 ml，各家兔關(guān)節(jié)滑膜液分別裝入Eppendorf管中，-20℃低溫冰箱保存待測細胞因子。抽取關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑膜液后，打開膝關(guān)節(jié)腔，用眼科直鑷鈍性分離關(guān)節(jié)囊的滑膜層和纖維層，完整剝離滑膜組織完整剪下，分別將所取滑膜組織迅速放入液氮罐中保存。

1.6 ELISA法檢測滑膜液MMP-3、VEGF的水平操作按照試劑盒說明書進行，全自動酶標儀450 nm波長依序測量各孔的吸光度(A值)，根據(jù)標準品的濃度及對應的A值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的A值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。

1.7 RT-qPCR檢測MMP-3、VEGF mRNA的表達水平

1.7.1 引物序列(Primer Premier 5.0軟件設(shè)計)由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。見表1。

1.7.2 隨機取幾個樣品，加入相應引物及SYBR green I進行預實驗，確定反應條件如下:Real-time PCR 20 μl反應體系為 cDNA 1 μl，上游引物 1 μl，下游引物 1 μl，PCR mix 10 μl，ddH2O 7 μl。將反應體系置于Real-time PCR儀上作用，反應條件為預變性95℃，2 min，變性 95℃，10 s，退火、延伸 60℃，40 s，共40個循環(huán);確定合適的PCR循環(huán)條件后，每個反應重復三次。觀察擴增結(jié)果，看Ct值和擴增曲線。用Real-time PCR相對定量的計算方法，計算出2-(△△Ct)以反映目的基因(相對于正常對照組)的表達水平。

1.8 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)分析采用SPSS16.0版軟件，所有數(shù)據(jù)結(jié)果均以±s表示，差異顯著性采用方差分析(ANOVA)檢驗，組間兩兩比較采用t檢驗，數(shù)據(jù)間相關(guān)性采用pearson檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 AA家兔滑膜液 MMP-3、VEGF細胞因子檢測結(jié)果 模型組與正常對照組比較，模型組MMP-3、VEGF細胞因子水平比正常對照組明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);治療組與模型組比較，三個治療組MMP-3、VEGF細胞因子水平比模型組均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與西藥MTX組比較，中藥 NDRF組、聯(lián)合組 MMP-3、VEGF細胞因子水平均低于西藥MTX組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);聯(lián)合組與中藥NDRF組比較，聯(lián)合組MMP-3、VEGF細胞因子水平均低于中藥NDRF組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。結(jié)果見表2。

表1 PCR引物序列Tab．1 The primer sequence for GAPDH，MMP-3 and VEGF

表2 AA家兔滑膜液 MMP-3、VEGF細胞因子檢測結(jié)果(n=8，±s)Tab．2 The MMP-3 and VEGF changes on the AA Rabbits'synovial(n=8，±s)

Note:Compared with Normal control，1)P ＜ 0.01;compared with Model，2)P ＜0.05，3)P ＜0.01;compared with MTX，4)P ＜0.01;compared with NDRF，5)P ＜0.05，6)P ＜0.01.

Groups Treatment MMP-3(μg/L) VEGF(ng/L)A Normal control 5.91±0.41 99.79±10.19 B Model 13.39±2.791) 212.00±18.871)C NDRF 7.66±1.203)4) 105.34±14.183)4)D MTX 11.84±0.622) 174.45±35.482)E NDRF+MTX 5.97±0.883)4)5) 85.20±5.683)4)6)

表3 AA家兔滑膜組織MMP-3、VEGFmRNA檢測結(jié)果(n=8，±s)Tab．3 The MMP-3 mRNA and VEGFmRNA changes on the AA Rabbits'synovial(n=8，±s)

表3 AA家兔滑膜組織MMP-3、VEGFmRNA檢測結(jié)果(n=8，±s)Tab．3 The MMP-3 mRNA and VEGFmRNA changes on the AA Rabbits'synovial(n=8，±s)

Note:Compared with Normal control，1)P ＜0.01;compared with Model，2)P ＜0.05，3)P ＜ 0.01;compared with MTX，4)P ＜0.01;compared with NDRF，5)P ＜0.01.

Groups Treatment MMP-3 ΔCt 2-(ΔΔCt)VEGF ΔCt 2-(ΔΔCt)A Normal control 10.148±0.054 1 10.344±0.1621 0.549 B Model 8.856±0.0551) 2.448 8.735±0.1341) 3.050 C NDRF 12.157±0.0073)4) 0.249 10.257±0.1283)4) 1.062 D MTX 10.388±0.0083) 0.847 9.033±0.0152) 2.489 E NDRF+MTX 13.659±0.0053)4)5) 0.088 11.209±0.1093)4)5)

2.2 AA家兔滑膜組織MMP-3 mRNA、VEGF mRNA基因的檢測結(jié)果 模型組與正常對照組比較，模型組 MMP-3 mRNA(2-(△△Ct)值)、VEGF mRNA(2-(△△Ct)值)明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);治療組與模型組比較，三個治療組均比模型組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與西藥MTX組比較，中藥NDRF組、聯(lián)合組均低于西藥 MTX組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);聯(lián)合組與中藥NDRF組比較，聯(lián)合組均低于中藥NDRF組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。結(jié)果見表3。

2.3 AA家兔滑膜組織MMP-3與滑膜MMP-3 mRNA水平相關(guān)性 AA家兔滑膜組織MMP-3的值分別與滑膜MMP-3 mRNA表達水平的相對定量值進行線性相關(guān)統(tǒng)計學分析，相關(guān)系數(shù)r=0.655，雙側(cè)pearson檢驗P＜0.01，有統(tǒng)計學意義，可見AA家兔滑膜組織MMP-3的含量與滑膜MMP-3 mRNA表達水平有密切的相關(guān)性，且存在顯著正相關(guān)關(guān)系。

2.4 AA家兔滑膜組織VEGF與滑膜VEGF mRNA水平相關(guān)性 AA家兔滑膜組織VEGF的值與滑膜VEGF mRNA表達水平的相對定量值進行線性相關(guān)統(tǒng)計學分析，相關(guān)系數(shù)r=0.905，雙側(cè)pearson檢驗P＜0.01，有統(tǒng)計學意義，可見AA家兔滑膜組織VEGF的含量與滑膜VEGF mRNA表達水平有密切的相關(guān)性，且存在顯著正相關(guān)關(guān)系。

3 討論

RA是一種以關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鞯穆远嘞到y(tǒng)炎癥性的自身免疫性疾病。RA的基本病理改變是滑膜炎，進而出現(xiàn)滑膜血管增生并伴有大量淋巴細胞浸潤形成血管翳，導致關(guān)節(jié)黏連，最后出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨和骨組織的破壞等病理改變。有研究表明，過度增生滑膜細胞及滑膜組織中浸潤的炎性細胞可能通過分泌大量細胞因子和蛋白酶，參與RA的發(fā)病和發(fā)展過程[4]。

由于RA病因尚未清楚，臨床治療棘手，目前西藥能短期緩解RA炎癥，但不能阻止病情的進展，需要長期治療，由于副作用明顯，患者難以堅持治療;抗TNF-α單抗等生物制劑治療效果較好，但其價格昂貴，應用受限。由于沒有理想治療藥物，中醫(yī)藥治療的研究成為了近年研究的熱點。RA屬中醫(yī)痹證范疇，許多中藥方劑具有控制炎癥和免疫調(diào)節(jié)等多方面的作用，且可以長期服藥[5]。本研究采用的是李均博士在臨床實踐中總結(jié)的中藥NDRF組方，為祛風除濕，補氣溫陽活血的獨創(chuàng)性組方，由羌活、獨活、防風和木瓜為主藥，主要功效為祛風勝濕，補氣溫陽活血，散寒止痛，臨床上治療RA具有較好療效。MTX是臨床上較早使用的抗風濕藥，其療效確定，服用方便，價格低廉被認為是治療RA的金標準，但其胃腸道反應等副作用明顯，多數(shù)患者難以耐受。為研究中藥NDRF組方的藥物作用及機制，探索積極有效的治療方案，本課題組唐艷麗[3]發(fā)現(xiàn)中藥NDRF及聯(lián)合MTX治療AA家兔關(guān)節(jié)沒有明顯病理損傷，本研究從致骨關(guān)節(jié)損傷分子及基因變化方面闡述中藥NDRF的作用機制，為其進一步的應用提供理論基礎(chǔ)。

近年研究表明血管新生和血管翳的形成在RA的發(fā)生發(fā)展過程中起了非常重要的作用[6，7]。VEGF是目前已知作用最強的促血管新生的細胞因子，VEGF與其受體(VEGFR)特異性結(jié)合，具有促進血管內(nèi)皮細胞增殖、促進炎癥反應和新生血管的形成等多重作用，參與RA的發(fā)病機制與病理改變等[8-10]?；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPs)是一組在結(jié)構(gòu)上具有極大同源性，能降解細胞外基質(zhì)蛋白的內(nèi)肽酶的總稱[11]。其中MMP-3屬于基質(zhì)分解素類，是MMPs中導致軟骨降解最重要的蛋白酶，可直接降解不同的細胞外基質(zhì)和基底膜成分，最終導致軟骨與骨組織的基質(zhì)成分的破壞。在RA致病過程中，MMP-3不僅降解細胞外基質(zhì)和基底膜成分，而且可促進血管翳對軟骨的侵蝕，在RA骨與軟骨的破壞過程中發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果表明，AA家兔模型滑膜組織MMP-3、VEGF細胞因子含量均明顯增高，其mRNA的相對含量也明顯增高，說明造模成功，同時也表明MMP-3、VEGF在 AA致炎中起重要作用;經(jīng)中藥NDRF及MTX治療后，三個治療組滑膜組織MMP-3、VEGF細胞因子含量及其mRNA相對含量均不同程度降低，其中聯(lián)合組降低最為明顯，其次為中藥NDRF組、西藥 MTX組，提示中藥 NDRF可降低MMP-3、VEGF蛋白與基因的表達，且聯(lián)合MTX的效果更為顯著。分析以上結(jié)果，可見中藥NDRF抑制致炎反應與MMP-3、VEGF的下調(diào)相關(guān)，為中藥NDRF對AA的治療提供了作用靶點，推測中藥NDRF及聯(lián)合MTX可能通過降低細胞因子VEGF水平，減輕細胞因子對滑膜細胞的刺激，同時減少MMP-3的分泌，從而抑制滑膜細胞的過度增生，抑制血管翳的形成，減輕軟骨與骨的破壞，起到阻止關(guān)節(jié)炎病程進展的作用。通過分析AA家兔滑膜組織MMP-3、VEGF與各自相應mRNA水平相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，二者均具有良好的正相關(guān)關(guān)系。從機理上討論，中藥NDRF聯(lián)合MTX可能從基因水平影響MMP-3、VEGF的蛋白表達，這在我們進行家兔X線影像學改變(待發(fā)表)，藥物治療前后在軟組織腫脹、骨侵蝕和關(guān)節(jié)間隙改變的評分方面看到相同的規(guī)律。

綜上所述，本研究結(jié)果表明 MMP-3、VEGF在AA模型的發(fā)病和關(guān)節(jié)損傷中起著重要作用;中藥NDRF可降低AA家兔滑膜組織中MMP-3、VEGF的產(chǎn)生，且聯(lián)合MTX作用更為明顯，說明中藥組方NDRF及聯(lián)合MTX可以減輕炎性細胞浸潤，抑制滑膜組織增生，減輕軟骨與骨的破壞，對AA家兔模型起到治療作用，本研究為進一步探討中藥及中西醫(yī)結(jié)合治療RA的機制提供理論基礎(chǔ)。

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