ESAT-6對人外周血γδT細(xì)胞IL-17的影響及其信號通路的研究①

王 娟 杜發(fā)旺 杜先智 (重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶400010)

IL-17是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的炎癥因子，主要由TH17細(xì)胞、γδT細(xì)胞、NKT細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種細(xì)胞因子、趨化因子以及炎癥相關(guān)效應(yīng)物，參與機(jī)體抗感染、腫瘤及自身免疫性疾病的發(fā)生及發(fā)展[1-3]，近年來大量的研究顯示 γδT 細(xì)胞能大量的產(chǎn)生 IL-17[4]，γδT 細(xì)胞產(chǎn)生IL-17受多種因素的影響，且和IL-17相關(guān)的疾病有著密切的聯(lián)系[3]。結(jié)核桿菌早期分泌抗原-6(Early secreted antigenic target-6，ESAT-6)是結(jié)核桿菌早期產(chǎn)生的分泌靶抗原，有多個(gè)T細(xì)胞抗原決定簇，有極強(qiáng)的免疫原性及抗原特異性，能激活γδT細(xì)胞的功能[5，6]。為了研究 ESAT-6 對 γδT 細(xì)胞 IL-17 表達(dá)的影響，本研究用ESAT-6刺激γδT細(xì)胞，并通過探討STAT3通路對ESAT-6刺激γδT細(xì)胞IL-17的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)的影響，從細(xì)胞內(nèi)信號的角度更深入的解析ESAT-6刺激γδT細(xì)胞的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 ESAT-6抗原、STAT3通路特異性抑制劑S3I-201購自美國Sigma公司，Trizon RNA提取試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTP、markerDL1000等PCR試劑及IL-17、STAT3引物購自大連寶生物TaKaRa公司，Western blot配膠試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，IP蛋白裂解液購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，尼龍毛柱購自日本W(wǎng)AKO公司，淋巴細(xì)胞分離液購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，白細(xì)胞介素-2(IL-2)購自Peprotech公司，Anti-human gamma delta TCR-FITC、Mouse IgG1 K Isotype Control FITC購自美國eBioscience公司，IL-17酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒購自美國Sigma公司，STAT3抗體購自購自Abcam公司，RPMI1640干粉、胎牛血清購自美國Gibco公司，流式細(xì)胞儀(FCM)購自美國Beckman Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞的制備 抽取健康志愿者血液40 ml，與Hank's液40 ml混勻后，取消毒滅菌的50 ml離心管2只，加入20 ml淋巴細(xì)胞分離液，將混勻的血液加入淋巴細(xì)胞分離液面上，注意保持分界面清晰。以2 000 r/min離心15 min，吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層，將吸取細(xì)胞加入5 ml PBS，以800 r/min，離心洗滌3 次，每次10 min，所得白色細(xì)胞沉淀即為外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞(PBMC)，將所得的單個(gè)核淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)入50 ml培養(yǎng)瓶中，加入3 ml含有10%的RPMI1640培養(yǎng)液，放置于5%、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 尼龍毛柱分離T淋巴細(xì)胞 將尼龍毛柱用37℃PBS和含有10%的RPMI1640培養(yǎng)液進(jìn)行浸潤預(yù)濕處理，將培養(yǎng)3 d的PBMC細(xì)胞用完全培養(yǎng)基RPMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度至108ml-1，加入經(jīng)預(yù)濕處理的尼龍毛柱中，上樣量約為1/3柱體積，再加入37℃的完全培養(yǎng)液 RPMI1640 5 ml，密封，放置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h，然后用 RPMI1640沖洗尼龍毛柱，收集所得細(xì)胞即為外周血T淋巴細(xì)胞。

1.2.3 γδT細(xì)胞分離純化及培養(yǎng) 將所得的外周血T淋巴細(xì)胞用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至108ml-1，加入Anti-human gamma delta TCR-FITC熒光抗體，以Mouse IgG1 K Isotype Control FITC熒光抗體為同型陰性對照，在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h，用流式細(xì)胞儀分離純化γδT細(xì)胞，即將消毒滅菌的一次性分離管插入濃縮的細(xì)胞中，將所有的T淋巴細(xì)胞經(jīng)一次性管道吸入流式細(xì)胞儀內(nèi)，由于FITC是屬于綠色熒光，經(jīng)綠色熒光通道出來后在另一端進(jìn)入準(zhǔn)備好的流式管內(nèi)就可以收集到綠色熒光標(biāo)記的純度較高的γδT細(xì)胞(全過程需要注意使用一次性分離管，并且流式細(xì)胞儀需要提前消毒，避免污染)，并檢測 γδT細(xì)胞的純度。將分離獲取的 γδT細(xì)胞培養(yǎng)于50 ml培養(yǎng)瓶中，加入3 ml完全培養(yǎng)基RPMI1640，同時(shí)加入唑來磷酸(終濃度為300 pg/ml)、IL-2(終濃度為200 I/ml)刺激γδT細(xì)胞擴(kuò)增，每隔2天換一次液，并同時(shí)加入同等濃度的唑來磷酸及IL-2，培養(yǎng)12天后，用RPMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度至105ml-1備用。

1.2.4 分組處理γδT細(xì)胞 將γδT細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，每孔中加入2×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，隨機(jī)分為四組:對照組(不加入ESAT-6及S3I-201)、ESAT-6刺激組(20 μg/ml)、ESAT-6+S3I-201 組、S3I-201組(S3I-201濃度為30 μmol/L)，將處理好的細(xì)胞放置于5%CO2、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，重復(fù)5次。

1.2.5 PCR檢測IL-17基因轉(zhuǎn)錄 將各處理組的細(xì)胞用Trizol法提取總RNA，并用紫外分光光度儀測RNAOD260 nm/OD280 nm值，確保比值介于1.8～2.0之間。并參照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄說明書獲得cDNA，以兩步法進(jìn)行RT-PCR，按照PCR說明書配制反應(yīng)液:SYBR?Prime EX TaqTMⅡ(2 ×)12.5 μl，PCR Forward Primer 10 μmol/L，PCR Reverse Prime 10 μm，cDNA 2 μl，并以 DEPC 水調(diào)整總反應(yīng)液至25 μl。設(shè)置 94℃預(yù)變性 3 min、94℃變性 30 s、57℃退火(內(nèi)參59℃退火)30 s、72℃延伸30 s(內(nèi)參延伸50 s)、35個(gè)循環(huán)(內(nèi)參30個(gè)循環(huán))后再72℃延伸2 min，即得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以3%的瓊脂糖電泳，用凝膠成像儀掃描成像。PCR引物見表1。

1.2.6 ELISA法檢測培養(yǎng)液中IL-17的含量 各處理組細(xì)胞在恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，取各培養(yǎng)組50 ml培養(yǎng)液，參照IL-17 ELISA說明書檢測IL-17的含量。

表1 PCR引物Tab．1 The primer of PCR

1.2.7 Western檢測STAT3蛋白 將需要檢測處理的γδT細(xì)胞提取總蛋白后，用BCA法檢測蛋白濃度，加入上樣buffer，用蛋白裂解液調(diào)整各實(shí)驗(yàn)組蛋白濃度至5 μg/ul，并在沸水中加熱10 min。配制8%的分離膠及濃縮膠，每孔加入60 μg蛋白樣品，電泳、切膠、并用PVDF膜轉(zhuǎn)膜，用PBST配制的5%脫脂奶粉封閉1 h，再用5%脫脂奶粉按照1∶1 000(β-actin內(nèi)參1∶3 000)稀釋兔抗人STAT3一抗4℃過夜封閉，次日用PBST洗膜3次，每次10 min，用5%脫脂奶粉按照1∶5 000稀釋加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，再用PBST洗膜3次，每次10 min，然后用ECL作為發(fā)光試劑顯影成像并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以±s表示，組與組之間采用t檢驗(yàn)，結(jié)果以P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 γδT細(xì)胞的純度 將外周血PBMC細(xì)胞培養(yǎng)3天后，用尼龍毛柱分離T淋巴細(xì)胞，再經(jīng)流式細(xì)胞儀分選純化γδT細(xì)胞，γδT細(xì)胞純度可達(dá)(86.4±4.2)%(圖1B)，該純度的γδT細(xì)胞可滿足其功能研究，圖1A為同型陰性對照，圖1。

2.2 各處理組γδT細(xì)胞STAT3 mRNA轉(zhuǎn)錄 經(jīng)加入不同干擾因子的各組細(xì)胞在培養(yǎng)24 h后，用PCR技術(shù)檢測各組 STAT3 mRNA的表達(dá)，ESAT-6組STAT3 mRNA的表達(dá)較其余3組明顯增加(P＜0.01)，ESAT-6+S3I-201組、S3I-201組較空白對照組STAT3 mRNA的減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，圖2。

2.3 各處理組γδT細(xì)胞對STAT3蛋白表達(dá) 經(jīng)不同處理后，各組 γδT細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用Western blot法檢測γδT細(xì)胞STAT3蛋白的變化，ESAT-6組STAT3蛋白的表達(dá)較其余各組明顯增強(qiáng)(P＜0.01)，ESAT-6+S3I-201組、S3I-201組STAT3蛋白的表達(dá)較空白對照組降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，圖3。

2.4 各處理組γδT細(xì)胞IL-17 mRNA轉(zhuǎn)錄 各處理組γδT細(xì)胞在5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用PCR技術(shù)檢測各組γδT細(xì)胞IL-17 mRNA含量的變化，PCR結(jié)果提示，ESAT-6組 IL-17mRNA的表達(dá)較其余各組明顯增加(P＜0.01)，S3I-201組IL-17mRNA的表達(dá)較空白對照組、ESAT-6+S3I-201組減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，ESAT-6+S3I-201組IL-17mRNA的表達(dá)較空白對照增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，圖4。

2.5 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-17含量的檢測用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-17的含量，結(jié)果提示ESAT-6組較其余三組IL-17的含量明顯增加(P＜0.01)，ESAT-6+S3I-201組IL-17的含量較空白對照組增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，S3I-201組IL-17含量較ESAT-6+S3I-201組、空白對照組IL-17含量的減少有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，圖5。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測γδT細(xì)胞純度Fig．1 The purity of γδT cells with flow cytometry

圖2 PCR檢測STAT3mRNA的表達(dá)Fig．2 The expression of STAT3mRNA detected by PCR

圖3 Western blot檢測STAT3的表達(dá)Fig．3 The expression of STAT3 protein tested by Western blot

圖4 PCR檢測IL-17mRNA的表達(dá)Fig．4 The expression of IL-17mRNA detected by PCR

圖5 細(xì)胞培養(yǎng)液IL-17的含量Fig．5 The expression IL-17 tested by ELISA

3 討論

不同群體的T細(xì)胞有著不同的表面標(biāo)志、來源、功能及生物學(xué)意義，根據(jù)其表面TCR受體的不同，將T淋巴細(xì)胞分為 αβT細(xì)胞和 γδT細(xì)胞，其中γδT細(xì)胞約占人外周血T淋巴細(xì)胞的0.5%-10%，且以Vγ9Vδ2 型 γδT 細(xì)胞為主，屬于CD4+、CD8+雙陰性細(xì)胞，其抗原的提呈及激活不受MHC限制，作用介于固有免疫與適應(yīng)性免疫之間[6]，在機(jī)體抗感染、腫瘤及自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要的作用。

ESAT-6是致病性結(jié)核分枝桿菌早期分泌的靶抗原，具有很強(qiáng)的抗原特異性及免疫原性，有多個(gè)T細(xì)胞抗原決定簇，能特異性激活 γδT細(xì)胞的功能[7]。

IL-17由TH17細(xì)胞分泌，有研究表明γδT細(xì)胞亦是體內(nèi)重要的IL-17來源，甚至比TH17細(xì)胞產(chǎn)生更多、更迅速[8]。IL-17與機(jī)體防御、自身免疫性疾病、腫瘤有著密切的聯(lián)系，在機(jī)體抗感染中，通過局部刺激來提高 CXCL1、CXCL8、G-CSF、CXCL9 等趨化因子，將中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)至炎癥部位，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[9，10];但同時(shí)也加重了局部的炎癥反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)顯示IL-17可與其他的細(xì)胞因子如IFN-γ、TNF-α、IL-1 等起協(xié)同作用，放大炎癥效應(yīng)[10，11]。在腫瘤方面，IL-17可促進(jìn)血管表皮細(xì)胞生長因子的生成，有利于血管的形成，促進(jìn)腫瘤的生長[12];然而，IL-17亦可同時(shí)誘導(dǎo)其他的淋巴細(xì)胞到腫瘤部位，促進(jìn)其他免疫細(xì)胞分泌淋巴因子，對腫瘤細(xì)胞起到殺傷作用。

STAT3途徑是經(jīng)典的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄途徑，能夠快速地將信號從細(xì)胞外傳到細(xì)胞內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)通過加入STAT3特異性抑制劑，Western blot及PCR可發(fā)現(xiàn)STAT3減少，并且可同時(shí)觀察到IL-17在上清液中的含量也隨之減少;有意思的是本實(shí)驗(yàn)同時(shí)觀察到ESAT-6+S3I-201刺激組，盡管STAT-3在mRNA及蛋白表達(dá)水平均下調(diào)，但I(xiàn)L-17在mRNA水平及上清液中的含量較空白對照組及S3I-201組的增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示ESAT-6刺激γδT細(xì)胞產(chǎn)生IL-17與STAT3通路關(guān)系密切;此結(jié)果不排除ESAT-6還可以通過其他的途徑刺激γδT細(xì)胞產(chǎn)生IL-17，有研究發(fā)現(xiàn)IL-1及IL-23等淋巴因子也可促進(jìn)γδT細(xì)胞產(chǎn)生 IL-17[13]，ESAT-6 刺激 γδT 細(xì)胞后，是否導(dǎo)致γδT細(xì)胞分泌 IL-1、IL-23等淋巴因子，進(jìn)而促進(jìn)IL-17的產(chǎn)生值得進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)顯示，ESAT-6能刺激γδT細(xì)胞產(chǎn)生大量的IL-17，且IL-17的產(chǎn)生與STAT3通路密切相關(guān)，也解析了炎癥反應(yīng)與信號通路及免疫細(xì)胞之間存在的相互聯(lián)系。通過本實(shí)驗(yàn)的研究，在IL-17相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，可通過藥物在信號通路水平阻斷STAT3的活化來減少IL-17的表達(dá)，也可通過外周藥物的刺激，活化γδT細(xì)胞等淋巴細(xì)胞來增加IL-17的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)IL-17不同的生物學(xué)作用，為治療相關(guān)疾病提供一定的臨床思路。

[1]Curtis MM，Way SS.Interleukin-17 in host defence against bacterial，mycobacterial and fungal pathogens [J].Immunology，2009，126(2):177-185.

[2]Miyahara Y，Odunsi K，Chen W，et al.Generation and regulation of human CD4+IL-17-producing T cells in ovarian cancer [J].Proc Nat1 Acad Sci USA，2008，105(40):15505-15510.

[3]Steinman L.Mixed results with modulation of TH-17 cells in human autoimmunediseases [J].Nat Immunol，2010，11(1):41-44.

[4]Murdoch JR，Lloyd CM.Resolution of allergic airway inflammation and airway hyperreactivity is mediated by IL-17-producing{gamma}{delta}T cells[J].Am J Respir crit Care Med，2010，182(4):464-476.

[5]Renshaw P S，Lightbody K L，Veverka V et al.Structure and function of the complex formed by the tuberculosis virulence factors CFP-10 and ESAT-6[J].EMBO J，2005，24(14):2491-2498.

[6]Holtmeier W，Kabelitz D.gammadelta T cells link innate and adaptive immune responses[J].Immunol Allergy，2005，86:151-183.

[7]何愉勝，杜先智.卡介苗與ESAT-6激活的γδT細(xì)胞表達(dá)抗原提呈細(xì)胞表型和功能的研究[J].中國免疫學(xué)雜志，2011，27(3):204-208.

[8]Huber M，Heink S，Grothe H et al.A Th17-like developmental process leads to CD8(+)Tc17 cells with reduced cytotoxic activity [J].Eur J Immunol，2009，39(7):1716-1725.

[9]Li J，Mo HY，Xiong G et al.Tumor microenvironment macrophage inhibitory factor directs the accumulation of interleukin-17-producing tumor-infiltrating lymphocytes and predicts favorable survival in nasopharyngeal carcinoma patients[J].J Biol Chem，2012，287(42):35484-35495.

[10]Lee JW，Wang P，Kattah MG，et al.Differential regulation of chemokines by IL-17 in colonic epithelial cells [J].J Immunol，2008，181(9):6536-6545.

[11]Hamada S，Umemura M.Shiono T，et al.IL-17A produced by gammadelta T cells plays a critical role in innate immunity against listeria monocytogenes infection in the liver [J].J Immunol，2008，181(5):3456-3463.

[12]Honorati MC，Neri S，Cattini，et al.Interleukin-17，a regulator of angiogenic factor release by synovial fibroblasts [J].Osteoarthritis Cartilage，2006，14(4):345-352.

[13]Sutton CE，Lalor SJ，Sweeney CM，et al.Interleukin-1 and IL-23 induce innate IL-17 production from gammadelta T cells，amplifying Th17 responses and autoimmunity[J].Immunity，2009，31(2):331-341.