電針對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響

林浴坤，陶靜，陳斌，林如輝

認(rèn)知功能是人類認(rèn)識和了解客觀事物的能力，由多個認(rèn)知領(lǐng)域組成，包括記憶、計算、時間定向、空間定向、結(jié)構(gòu)能力、執(zhí)行能力、語言理解和表達(dá)應(yīng)用等方面。腦卒中后的認(rèn)知功能障礙發(fā)生率達(dá)65%[1]，常出現(xiàn)記憶力、空間認(rèn)知、計算力、推理能力、注意力、定向力等多個認(rèn)知領(lǐng)域受損。越來越多的證據(jù)表明，認(rèn)知功能障礙影響患者日常生活活動能力以及運(yùn)動功能的恢復(fù)，是制約腦卒中患者全面康復(fù)的重要因素[2-3]。約10%～40%的輕度認(rèn)知障礙患者在1年內(nèi)可發(fā)展為癡呆[4-8]。因此，早期發(fā)現(xiàn)并及時干預(yù)認(rèn)知障礙對患者身心功能的全面恢復(fù)和預(yù)防癡呆有著特別重要的意義。電針療法是傳統(tǒng)治療行之有效的方法之一，可通過多途徑、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)起作用。本實(shí)驗采用線栓法制備局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠模型，觀察電針神庭、百會對局灶性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響，以及海馬神經(jīng)細(xì)胞及Bcl-2、Bax mRNA的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物及分組

健康成年無特殊病原體(SPF)級Sprague-Dawley大鼠45只，體質(zhì)量(240±20)g。由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物中心提供，許可證號：SYXK(閩)2005-004。大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠5只；適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠編號，分為假手術(shù)組(n=15)、模型組(n=15)和電針組(n=15)。

1.2 主要實(shí)驗試劑及儀器

1.2.1 試劑 尼氏染色液：碧云天公司。Trizol：INVITROGEN。cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR Master Mix：FERMENTAS。Bcl-2、Bax mRNA上下游引物：上海生工公司合成。

1.2.2 儀器 PCR儀：Bio-Rad,Model Gel Doc 2000。水迷宮實(shí)驗裝置及動態(tài)圖像采集分析系統(tǒng)：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。YF-7 FB型攤片烤片機(jī)：湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司。華佗牌電子針療儀：蘇州醫(yī)療用品廠有限公司。

1.3 動物模型制備

術(shù)前所有實(shí)驗動物禁食12 h。大鼠稱重，參考Longa方法，行左側(cè)大腦中動脈線栓術(shù)(MCAO)，制備急性腦梗死動物模型。10%水合氯醛3 ml/kg腹腔麻醉，常規(guī)去毛消毒，分離頸總動脈，向上分離出頸內(nèi)動脈和頸外動脈主干及分支；在頸內(nèi)、外動脈分叉處結(jié)扎頸外動脈，在近心端結(jié)扎頸總動脈。用動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈，然后在頸總動脈結(jié)扎處遠(yuǎn)端約3 mm處剪一小口，將備好的尼龍線經(jīng)切口導(dǎo)入，從頸外動脈與頸內(nèi)動脈分叉處插入約18～22 mm，有少許阻力為止。頸部傷口常規(guī)縫合。2 h后緩慢退出尼龍線。動物室溫(25℃)環(huán)境下蘇醒，正常飲食。實(shí)驗過程和動物蘇醒期間注意保暖。

假手術(shù)組只分離動脈，不結(jié)扎、插線。

動物蘇醒后觀察其體態(tài)及行為，不合格的動物剔除。

1.4 干預(yù)方法

電針組參考《常用動物腧穴圖譜》取大鼠神庭和百會穴，應(yīng)用電針刺激，疏密波，頻率1～20 Hz，電壓3～5 V，以針體輕輕抖動為度。每次30 min，每天同一時間治療1次。手術(shù)后2 h開始，直至動物被處死。模型組、假手術(shù)組置于普通籠中飼養(yǎng)，只給予同等條件抓取，未給予任何治療。

1.5 Morris水迷宮

Morris水迷宮為直徑200 cm、高50 cm的圓形水池，水深30 cm；水溫(25±2)℃；圓形逃逸平臺直徑6 cm，低于水面2 cm，置于某一象限中央。室溫25℃，屋頂和四壁表面光滑整潔，照明設(shè)備四周對稱。各組造模后第3天開始檢測。

定位航行試驗歷時4 d。大鼠自由游泳2 min適應(yīng)環(huán)境和人的抓握等相關(guān)操作。分別從水池4個象限將大鼠面向池壁放入水中，測其在90 s內(nèi)尋找到平臺所需的時間(逃避潛伏期)，由計算機(jī)記錄各種參數(shù)。如果大鼠90 s內(nèi)未找到平臺，需將其牽引到平臺，停留10 s，這時潛伏期記為90 s。

空間探索試驗：在第7天撤除平臺，記錄大鼠在90 s內(nèi)穿過平臺所在位置的次數(shù)。由計算機(jī)記錄各種參數(shù)。

1.6 取材及檢測

1.6.1 尼氏染色 各組大鼠行為測試完畢后，10%水合氯醛3 ml/kg腹腔麻醉，立即開胸暴露心臟，穿刺針從心尖部刺入心臟，調(diào)整方向?qū)ふ抑鲃用}出口，忌用力穿破心臟；進(jìn)入主動脈后止血鉗固定針頭。剪開右心耳，快速灌注生理鹽水量約300 ml，4%多聚甲醛(pH=7.4)400 ml灌流固定。取腦，置入4%多聚甲醛內(nèi)4℃固定24～48 h。定位腦缺血區(qū)，常規(guī)脫水，石蠟包埋，冠狀切片，片厚5μm。二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，行尼氏染色，嚴(yán)格按照說明操作。

1.6.2 RT-PCR 提取左側(cè)海馬組織RNA；按照試劑盒說明書操作，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按PCR Master Mix試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列如下。Bcl-2

上游：5′-GGTGGTGGA GGAACTCTTCA-3′

下游：5′-GAGCAGCGTCTTCAGAGA CA-3′Bax

上游：5′-GAGCAGCGTCTTCAGAGA CA-3′

下游：5′-TCA CGGAGGAAGTCCAGT GT-3′β-actin

上游：5′-ACTGGCATTGTGATGGACTC-3′

下游：5′-CAGCACTGTGTT GGCATA GA-3′

擴(kuò)增體系20μl，其中cDNA模板1μl，上下游引物各0.4 μl，Mix 10 μl，加水8.2 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)。取PCR產(chǎn)物5μl，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色鑒定，凝膠成像。計算圖像軟件分析電泳條帶。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均滿足方差齊性(P>0.05)，數(shù)據(jù)以表示，采用ANOVA分析，兩兩比較采用LSD法。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮

電針組逃避潛伏期較模型組顯著下降(P<0.001)。見表1。電針組大鼠穿過平臺次數(shù)(1.78±0.42)，顯著高于模型組(0.74±0.26)(P=0.001)。見圖1。

2.2 尼氏染色

假手術(shù)組尼氏染色清晰均勻，細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞核大而圓，核仁清晰，尼氏體染色濃密規(guī)則，呈紫藍(lán)色。模型組細(xì)胞排列松散，細(xì)胞體積較小，胞核固縮，尼氏小體減少，細(xì)胞溶解，染色呈淡藍(lán)染或空染，形態(tài)不規(guī)則，分布不均。電針組相比模型組尼氏小體較多，染色較均勻，呈藍(lán)色，細(xì)胞形態(tài)相對完整見圖2。

2.3 PCR

模型組大鼠海馬組織中Bcl-2 mRNA光密度較假手術(shù)組降低，Bax mRNA光密度較假手術(shù)組升高，Bcl-2/Bax較假手術(shù)組顯著降低(P=0.000)；與模型組相比，電針組大鼠海馬組織中Bcl-2 mRNA光密度升高，Bax mRNA光密度降低，Bcl-2/Bax的比值升高(P=0.023)。見圖3。

圖1 各組Morris水迷宮穿過平臺次數(shù)比較

圖2 各組腦死區(qū)尼氏染色(100×)

圖3 各組腦海馬組織RT-PCR結(jié)果

3 討論

中醫(yī)理論認(rèn)為，認(rèn)知功能與督脈密切相關(guān)。認(rèn)知障礙與中醫(yī)“健忘”“失智”“癡呆”等病癥相關(guān)，其病位在腦，而與心、肝、脾、腎臟腑功能失調(diào)有密切關(guān)系；其病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，以精氣虧虛，髓?？仗摓楸荆蕴禎嶙韪[、瘀阻腦絡(luò)為標(biāo)。督脈與腦及五臟六腑關(guān)系密切。臨床相關(guān)研究也表明，針灸督脈穴位可促進(jìn)認(rèn)知功能的改善[9-10]。

本課題組對督脈穴位進(jìn)行篩選，表明神庭、百會是古文獻(xiàn)記載也是現(xiàn)在研究較多的穴位，兩穴通常合用，具有開竅醒神、補(bǔ)腎養(yǎng)精的作用。課題組前期研究也表明，電針神庭、百會可改善認(rèn)知功能[11]。

傳統(tǒng)認(rèn)為，腦缺血中細(xì)胞壞死占主導(dǎo)。近年來研究者發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡也是腦缺血中神經(jīng)元死亡的一種主要方式。其中Bcl-2和Bax是Bcl-2家族細(xì)胞凋亡過程中重要的調(diào)節(jié)因子[12-13]。Bax與Bcl-2功能相反，當(dāng)組織內(nèi)Bax占優(yōu)勢，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡；當(dāng)Bcl-2占優(yōu)勢則抑制細(xì)胞凋亡[14]。大鼠局灶性腦缺血存在Bcl-2和Bax的表達(dá)，Bcl-2和Bax的比例決定細(xì)胞凋亡的趨勢[15]。本研究顯示，模型組海馬組織Bax表達(dá)占優(yōu)勢，致使海馬神經(jīng)元凋亡，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙；而電針組可增加Bcl-2表達(dá)，降低Bax的表達(dá)，從而改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

認(rèn)知功能障礙不是一個獨(dú)立的臨床表現(xiàn)，由多個領(lǐng)域組成，其中最為基礎(chǔ)的是學(xué)習(xí)記憶功能。海馬作為人類學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵部位，也是腦缺血敏感的區(qū)域[16]。當(dāng)海馬組織缺血時，海馬及其周圍神經(jīng)細(xì)胞的凋亡會導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶下降[17]。

本研究顯示，模型組存在學(xué)習(xí)記憶功能障礙；而電針干預(yù)后，大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能得到改善。這與韓曉華等研究結(jié)果一致[18]。

尼氏小體是結(jié)構(gòu)蛋白和分泌蛋白的合成中心，當(dāng)神經(jīng)元受到損害時，尼氏小體逐漸解散或消失，神經(jīng)元的尼氏染色變淡或空染。本研究尼氏染色也觀察到電針可以減少胞核固縮，保護(hù)尼氏小體的完整。

綜上所述，電針神庭、百會可改善局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞；作用機(jī)制可能包括調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)。

[1]Donovan NJ,Kendall DL,Heaton SC,et al.Conceptualizing functional cognition in stroke[J].Neurorehabil Neural Repair,2008,22(2):122-135.

[2]Savva GM,Stephan BC.Epidemiological studies of the effect of stroke on incident dementia:a systematic review[J].Stroke,2010,41(1):e41-e46.

[3]陳少貞,江沁,劉鵬,等.認(rèn)知康復(fù)對腦卒中偏癱患者功能獨(dú)立的影響[J].中國臨床康復(fù),2006,10(18):14-16.

[4]Busse A,Bischkopf J,Riedel-Heller SG,et al.Mild cognitive impairment:prevalence and incidence according to different diagnostic criteria.Results of the Leipzig Longitudinal Study of the Aged(LEILA75+)[J].Br JPsychiatry,2003,182:449-454.

[5]Geslani DM,Tierney MC,Herrmann N,et al.Mild cognitive impairment:an operational definition and its conversion rate to Alzheimer's disease[J].Dement Geriatr Cogn Disord,2005,19(5-6):383-389.

[6]Modrego PJ,Fayed N,Pina MA.Conversion from mild cognitive impairment to probable Alzheimer's disease predicted by brain magnetic resonancespectroscopy[J].Am JPsychiatry,2005,162(4):667-675.

[7]Petersen RC,Doody R,Kurz A,et al.Current concepts in mild cognitiveimpairment[J].Arch Neurol,2001,58(12):1985-1992.

[8]Ravaglia G,Forti P,Maioli F,et al.Conversion of mild cognitive impairment to dementia:predictive role of mild cognitive impairment subtypes and vascular risk factors[J].Dement Geriatr Cogn Disord,2006,21(1):51-58.

[9]劉振寰,潘佩光,錢旭光,等.通督醒神針刺法對腦癱患兒神經(jīng)發(fā)育及修復(fù)的臨床研究[C].合肥:全國第九屆兒童發(fā)育與臨床學(xué)術(shù)研討會,2012.

[10]朱才豐,楊駿,費(fèi)愛華,等.針灸療法對認(rèn)知功能障礙的影響(英文)[J].JAcupunct Tuina Sci,2012,10(4):218-222.

[11]Feng X,Yang S,Liu J,et al.Electroacupuncture ameliorates cognitive impairment through inhibition of NF-kappaB-mediated neuronal cell apoptosis in cerebral ischemia-reperfusion injured rats[J].Mol Med Rep,2013,7(5):1516-1522.

[12]祁存芳,張軍峰,陳新林,等.紅景天苷通過抑制凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)保護(hù)缺氧對培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的損傷[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2013,33(7):962-966.

[13]張強(qiáng),蘭晶,熊婷,等.頸動脈狹窄對大鼠認(rèn)知功能及海馬神經(jīng)元凋亡的影響[J].中國腦血管病雜志,2010,7(9):482-486.

[14]Sola S,Morgado AL,Rodrigues CM.Death receptors and mitochondria:two prime triggers of neural apoptosis and differentiation[J].Biochim Biophys Acta,2013,1830(1):2160-2166.

[15]Ouyang YB,Giffard RG.Cellular neuroprotective mechanismsin cerebral ischemia:Bcl-2 family proteins and protection of mitochondrial function[J].Cell Calcium,2004,36(3-4):303-311.

[16]孔妍,唐強(qiáng),朱路文,等.缺氧缺血性腦損傷后針康法對幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬微管相關(guān)蛋白-2表達(dá)的影響[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2011,17(4):310-312.

[17]Dolek N,Saylisoy S,Ozbabalik D,et al.Comparison of hippocampal volumemeasured using magnetic resonance imaging in Alzheimer's disease,vascular dementia,mild cognitive impairment and pseudodementia[J].JInt Med Res,2012,40(2):717-725.

[18]Han X,Zhao X,Lu M,et al.Electroacupuncture ameliorates learning and memory via activation of the CREB signaling pathway in the hippocampus to attenuate apoptosis after cerebral hypoperfusion[J].Evid Based Complement Alternat Med,2013,2013:156489.