白芍總苷對(duì)實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎大鼠腦組織IL-17含量影響的研究

陳俊先，李作孝

多發(fā)性硬化（Multiple sclerosis，MS）目前普遍認(rèn)為是一種自身免疫功能異常的慢性疾病，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system，CNS）白質(zhì)炎性脫髓鞘為主要特點(diǎn)。病變可累及腦室周圍白質(zhì)、腦干、小腦、脊髓、視神經(jīng)等重要部位。MS 的具體發(fā)病原因及機(jī)制均有待進(jìn)一步研究。目前更傾向認(rèn)為MS 的發(fā)病機(jī)制與自身免疫反應(yīng)相關(guān)。對(duì)MS 治療多采用皮質(zhì)類固醇激素等免疫抑制劑抑制炎性脫髓鞘反應(yīng)，起到抗炎和免疫調(diào)節(jié)的作用。但長(zhǎng)期使用不良反應(yīng)多。故發(fā)揮祖國(guó)中醫(yī)學(xué)的優(yōu)勢(shì)，從中藥中發(fā)現(xiàn)對(duì)MS治療的有效成分值得進(jìn)一步研究。白芍總苷（Total glucosidesofpaeony，TGP）是從中藥白芍根中提取的復(fù)合物，目前臨床已用于治療自身免疫性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、干燥綜合癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等。但TGP用于治療MS 的研究較少。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）模型其臨床表現(xiàn)與MS 相似，被公認(rèn)是研究MS 的理想動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)通過制作大鼠EAE模型及TGP對(duì)發(fā)病大鼠的干預(yù)治療，探討TGP 對(duì)EAE 大鼠發(fā)病及腦組織IL-17含量的影響。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只雌性大鼠，7～8周齡，體重180～220g；5 只豚鼠，體重400～450g。由瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供。飼養(yǎng)均為統(tǒng)一鼠飼料及飲用水。喂養(yǎng)期間保證動(dòng)物房的通風(fēng)、清潔及溫度。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 氟氏完全佐劑（美國(guó)Sigma 公司）；IL-17 ELISA 試劑盒（深圳晶美生物工程有限公司）；白芍總苷膠囊（浙江寧波立華制藥有限公司）；中性甲醛固定液由病理教研室提供。

2 方 法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將統(tǒng)一飼養(yǎng)的30只雌性大鼠隨機(jī)分為三組，每組10 只，分別為正常對(duì)照組、EAE 對(duì)照組及TGP治療組。

2.2 建立EAE 模型［1］處死豚鼠后，無菌操作下快速剝離出其脊髓，去掉馬尾與脊膜，稱重后放入玻璃均漿器，加入生理鹽水研磨成50%勻漿，與等量福氏完全佐劑混合后裝入無菌玻璃注射器，并來回推動(dòng)封好的注射器，反復(fù)抽打成油包水乳液，從而制得合格的EAE 造?？乖７謩e將所制的抗原以每只每側(cè)0.2ml 的劑量注入EAE 對(duì)照組和TGP 治療組大鼠雙后肢足掌皮下。正常對(duì)照組注射等劑量生理鹽水。

2.3 模型藥物干預(yù) 成功建立EAE模型后常規(guī)飼養(yǎng)各組。從造模當(dāng)天開始，連續(xù)20 天TGP 治療組每日一次給予TGP180mg/（kg.d）灌胃，正常對(duì)照組及EAE對(duì)照模型組連續(xù)20天每日給予等量生理鹽水灌胃。

2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物神經(jīng)功能評(píng)分及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 于建模成功后第1天開始，每日上午10時(shí)由同一人單盲觀察發(fā)病情況，對(duì)各組大鼠行神經(jīng)功能障礙評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0 分：無癥狀；1 分：后肢不全癱瘓；2 分：后肢完全癱瘓；3分：后肢全癱伴前肢不全癱；4分：四肢全癱或死亡；5分：趨于死亡。癥狀介于兩條標(biāo)準(zhǔn)之間者以±0.5分計(jì)。得分高說明神經(jīng)功能受損重。

2.5 確定終止實(shí)驗(yàn)時(shí)間 將出現(xiàn)連續(xù)3 天癥狀評(píng)分無加重、四肢癱瘓、死亡的發(fā)病大鼠時(shí)間作為EAE發(fā)病的高峰期，并在此時(shí)處死動(dòng)物；未發(fā)病的動(dòng)物觀察一月后處死。

2.6 大鼠腦組織IL-17含量的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)終止時(shí)，每只大鼠用生理鹽水灌注心臟后，逐層剝開大鼠枕頂部皮膚，用鑷子打開顱蓋骨，避免破壞腦組織。將生理鹽水與所取出腦組織按9:1的比例制成10%腦組織勻漿，然后采用固相夾心法聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）測(cè)定IL-17的含量。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理由SPSS 17.0 軟件完成。采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果，采用t 檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間樣本均數(shù)比較，采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。

3 結(jié)果

3.1 發(fā)病情況 正常對(duì)照組大鼠精神活動(dòng)可，體重正常增加。EAE對(duì)照組及TGP治療組發(fā)病動(dòng)物表現(xiàn)為精神差、攝食活動(dòng)減少、毛色暗淡、體重下降、共濟(jì)失調(diào)、癱瘓等，嚴(yán)重伴大小便失禁、抽搐、死亡等，但TGP治療組發(fā)病較EAE對(duì)照組癥狀輕。EAE對(duì)照組和TGP治療組發(fā)病潛伏期、進(jìn)展期、高峰期癥狀評(píng)分見表1。

表1 各組發(fā)病潛伏期、進(jìn)展期、高峰期癥狀評(píng)分比較（±s）

表1 各組發(fā)病潛伏期、進(jìn)展期、高峰期癥狀評(píng)分比較（±s）

注：▼與EAE對(duì)照組比較，P＜0.01。

3.2 EAE對(duì)照組、TGP治療組及正常對(duì)照組大鼠IL-17水平變化，見表2。

表2 各組大鼠腦組織IL-17含量（±s）

表2 各組大鼠腦組織IL-17含量（±s）

注：▼與正常對(duì)照組比較，P＜0.01；★與EAE 對(duì)照組比較，P＜0.01。

從表2結(jié)果可以看出：EAE對(duì)照組和TGP治療組IL-17含量均高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；EAE對(duì)照組和TGP治療組比較，TGP治療組IL-17含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 討論

目前認(rèn)為MS是自身免疫性疾病，而細(xì)胞因子是在免疫系統(tǒng)疾病免疫應(yīng)答中起重要作用。目前研究認(rèn) 為TCD4+Th 細(xì)胞亞群主要分3 類：Th1、Th2、Th17。Th1 型細(xì)胞因子與EAE 發(fā)病相關(guān)，包括IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α、INF-γ等；Th2 型細(xì)胞因子可抑制EAE 的發(fā)病，包括IL-10、IL-4 等。新發(fā)現(xiàn)的Th17 型細(xì)胞因子主要產(chǎn)生IL-17,IL-17是有很強(qiáng)促炎作用的細(xì)胞因子。IL-17 作為炎癥介質(zhì)參與炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展［2］，可以刺激靶細(xì)胞釋放炎癥細(xì)胞因子及動(dòng)員中性粒細(xì)胞發(fā)揮作用，誘導(dǎo)IL-6、PGE2、NO 的產(chǎn)生，上調(diào)TNF-a、INF-r 的基因表達(dá)致炎癥進(jìn)展。IL-17還可以提高CXC趨化因子表達(dá)，上調(diào)共刺激分子、主要組織相容復(fù)合物抗原等促進(jìn)DC成熟，協(xié)同刺激T 細(xì)胞的活化；可通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)各因子的轉(zhuǎn)錄及蛋白合成。IFN-γ可在靶組織中持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，IL-17 峰在EAE 模型中出現(xiàn)在IFN-γ之前，因此IL-17、IFN-γ可能在誘導(dǎo)自身免疫性疾病中起協(xié)同作用［3］。EAE大鼠體內(nèi)產(chǎn)生IL-17炎性細(xì)胞因子參與髓鞘破壞，直接作用內(nèi)皮細(xì)胞破壞血腦屏障而進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)導(dǎo)致進(jìn)一步脫髓鞘改變，引起EAE 病情加重。Th17 細(xì)胞在EAE 發(fā)病中也有不可或缺的作用。

白芍總苷（total glucosides of paeony，TGP）是從中藥白芍根中提取的復(fù)合物，其主要活性成分為芍藥苷。具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、保護(hù)腦缺血等作用。近期也有一些關(guān)于TGP 針對(duì)IL-17 治療相關(guān)疾病的研究報(bào)道。其中任曉麗等［4］研究發(fā)現(xiàn)慢性蕁麻疹患者的血清中存在高水平的IL-4和IL-17。TGP可能通過影響Th2、Th17細(xì)胞相關(guān)因子來發(fā)揮治療慢性蕁麻疹的作用，經(jīng)TGP 治療后其血清中IL-4 和IL-17明顯降低。賀勤等［5］研究發(fā)現(xiàn)TGP 能降低銀屑病皮損中IL-17的含量。TGP其對(duì)銀屑病的治療作用可能涉及對(duì)患者皮膚Th17細(xì)胞的影響。張宇虹等［6］研究發(fā)現(xiàn)TGP 可治療銀屑病。其機(jī)制可能與通過調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-17和IL-23發(fā)揮治療銀屑病作用。劉國(guó)玲等［7］研究發(fā)現(xiàn)TGP能抑制佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥反應(yīng)。其作用機(jī)制可能是TGP可降低炎性細(xì)胞因子IL-17 和血清VEGF 的產(chǎn)生，下調(diào)NFκB/p65蛋白的表達(dá),最終抑制炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及血管增生。綜上可以得出TGP可以通過下調(diào)Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-17 水平減輕炎癥反應(yīng)，緩解相關(guān)癥狀有著重要作用。

目前國(guó)內(nèi)多將白芍總苷用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、強(qiáng)直性脊柱炎、糖尿病腎病、銀屑病等。而鮮有TGP用于EAE和MS方面的報(bào)道。而TGP對(duì)MS是否具有預(yù)防治療作用，同時(shí)對(duì)EAE 和MS 中IL-17 含量是否有影響，朱駿［8］觀察了TGP主要的藥物活性成分芍藥苷（pae oniflori，PF）對(duì)MOG EAE 小鼠模型的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PF 在MOG EAE小鼠模型中能夠緩解炎性脫髓鞘過程，改善臨床癥狀。機(jī)制與上調(diào)抑制性細(xì)胞因子、下調(diào)致炎性細(xì)胞因子、減低淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、上調(diào)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞、激動(dòng)A1AR 而抑制神經(jīng)炎性反應(yīng)和發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析提示正常對(duì)照組大鼠未發(fā)病，EAE 對(duì)照組大鼠均出現(xiàn)不同程度的EAE 癥狀，故造模成功。通過各組大鼠的發(fā)病癥狀比較及對(duì)各組大鼠腦組織IL-17 含量測(cè)定可以得出以下結(jié)論:正常對(duì)照組大鼠腦組織勻漿中IL-17 的含量未升高，EAE 對(duì)照組、TGP 治療組大鼠腦組織勻漿中IL-17 的含量均明顯升高；TGP治療組大鼠發(fā)病晚、病情輕，腦組織勻漿中IL-17的含量也較EAE對(duì)照組低。說明IL-17有促進(jìn)EAE 作用，抗IL-17 抗體能防止IL-17 在腦內(nèi)的表達(dá)和EAE 的發(fā)生［9］。TGP 治療組大鼠的腦組織勻漿中IL-17的含量下降，則大鼠的EAE癥狀可得到明顯緩解。故對(duì)EAE具有明顯的保護(hù)作用。說明TGP可通過降低EAE 大鼠腦組織中的IL-17 水平來起到抑制EAE的作用。

Th17 型細(xì)胞因子主要產(chǎn)生IL-17，IL-17 對(duì)EAE發(fā)病起促進(jìn)作用，故下調(diào)抑制IL-17分泌可對(duì)EAE起到防治作用。雖然TGP 在治療MS 還處于EAE 的實(shí)驗(yàn)研究階段，但隨著對(duì)其治療機(jī)制及MS病因的深入研究。發(fā)揮TGP其抑制Th17型細(xì)胞因子等作用可能是MS臨床治療的一種新的選擇和方向。

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