豬附紅細(xì)胞體陽(yáng)性血清的制備研究

周 偉，劉 凡，賈杏林，唐 麗，朱珍珍，李曉云

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128）

豬附紅細(xì)胞體陽(yáng)性血清的制備研究

周 偉，劉 凡，賈杏林※，唐 麗，朱珍珍，李曉云

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128）

豬附紅細(xì)胞體寄生于紅細(xì)胞表面或游離于血漿、組織液及腦脊液中，引起豬發(fā)熱、溶血性貧血和黃疽等主要癥狀。本試驗(yàn)用豬附紅細(xì)胞體抗原和弗氏佐劑乳化制備免疫原，免疫健康仔豬，并通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清的效價(jià)，當(dāng)測(cè)得免疫豬血清的OD值與陰性對(duì)照豬的血清值之比（P/N）為8.16（P/N＞2.1），采集免疫豬血分離陽(yáng)性血清，本試驗(yàn)探索出了豬附紅細(xì)胞體陽(yáng)性血清的制備方法。

豬附紅細(xì)胞體；陽(yáng)性血清；免疫；ELISA

豬附紅細(xì)胞體病是由附紅細(xì)胞體（Mycoplasma suis)寄生于紅細(xì)胞表面或者血漿，組織液，腦脊液和骨髓中引起的一種疾病[1]。該病臨床癥狀表現(xiàn)為貧血、黃疸、發(fā)熱、毛產(chǎn)量及乳、肉產(chǎn)量減少、生育力下降，而且還引起較重的臨床表現(xiàn)及死亡等主要癥狀[2]。1932年，Doyle首次報(bào)道了豬附紅體病，

并認(rèn)為其病原體是類立克次體，其病原體的形態(tài)結(jié)構(gòu)也尚未完全研究清楚，也沒(méi)有有效可用的疫苗[3～5]。迄今為止，世界近30多個(gè)國(guó)家和地區(qū)發(fā)現(xiàn)該病的發(fā)生，我國(guó)已有22個(gè)省、市、自治區(qū)陸續(xù)報(bào)道了此病，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重危害[6～8]。免疫血清在疾病的緊急預(yù)防、治療、疾病診斷和病原鑒定方面有很大的作用[9]，本研究進(jìn)行了豬附紅細(xì)胞體陽(yáng)性血清的制備研究。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)儀器和試劑

儀器設(shè)備：微量分光光度計(jì)（Thermo NANO DROP 2000）、酶標(biāo)儀、無(wú)菌操作臺(tái)、高速離心機(jī)、高壓滅菌鍋。

試劑：弗氏完全佐劑、TMB購(gòu)自Sigma公司；酶標(biāo)二抗（1∶1 000）購(gòu)自索萊寶公司。

試驗(yàn)動(dòng)物：健康仔豬A 5.34kg，健康仔豬B 5.80kg，購(gòu)自長(zhǎng)沙縣某規(guī)模豬場(chǎng)。豬附紅細(xì)胞體抗原由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院李曉云博士等人提供。

2 試驗(yàn)內(nèi)容

2.1 抗原乳化

在無(wú)菌條件下取出的抗原溶液，12 000r/min離心約10min，棄上清液，加一定的無(wú)菌生理鹽水離心洗滌2次后，加入一定量的無(wú)菌生理鹽水懸浮抗原，用微量分光光度計(jì)A260/A280測(cè)定蛋白濃度，將抗原溶液稀釋到8.333mg/mL，加等量的弗氏完全佐劑乳化，使抗原溶液乳化均勻。

2.2 免疫

無(wú)菌取1.5mL的豬附紅細(xì)胞體12 000r/min離心10min，棄掉上清液后，加入等量的生理鹽水重懸豬附紅細(xì)胞體，多次洗滌以后，再加入等體積弗氏佐劑均勻混合。利用磁力攪拌器使得豬附紅細(xì)胞體懸液、弗氏佐劑乳化均勻，抗原含量為4.38×108/mL。在飼喂7d后，觀察仔豬的精神狀態(tài)、測(cè)定其體溫、呼吸、脈搏等生理指標(biāo)，確定仔豬健康后采用肌肉注射的方式對(duì)仔豬進(jìn)行多點(diǎn)免疫，首免后7d加免1次、加免后15d再加免1次，首免后每天測(cè)定體溫，以后隔3d測(cè)體溫，并觀察仔豬的精神狀態(tài)和食欲情況，前腔靜脈采血，分離血清4℃保存，用行ELISA檢測(cè)血清中的抗體水平變化，當(dāng)抗體達(dá)到較高值時(shí)，心臟采血，分離到的血清即為陽(yáng)性血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 間接ELISA檢測(cè)抗體

通過(guò)方陣試驗(yàn)，當(dāng)抗原濃度為80μg/mL，血清1∶40倍稀釋時(shí)P/N值最大，所以選擇該條件為最佳抗原，以最佳抗原濃度包被抗原，4℃過(guò)夜，用1%BSA封閉，加入1∶40稀釋后的血清，作用一定時(shí)間后加入1∶1 000稀釋的酶標(biāo)二抗，37℃作用45min，洗滌 5 次后，加 TMB，37℃顯色 15min，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450nm的吸光值。

2.4 動(dòng)物免疫后生理狀況以及抗體消長(zhǎng)情況

測(cè)定各階段的體溫，并觀察其生理狀況變化。按照上述確定的最佳包被濃度和血清稀釋倍數(shù)后進(jìn)行ELISA對(duì)免疫后的血清進(jìn)行檢測(cè)，觀察在不同的免疫時(shí)間后的抗體水平的變化。

2 試驗(yàn)內(nèi)容

2.1 抗原乳化

在無(wú)菌條件下取出的抗原溶液，12 000r/min離心約10min，棄上清液，加一定的無(wú)菌生理鹽水離心洗滌2次后，加入一定量的無(wú)菌生理鹽水懸浮抗原，用微量分光光度計(jì)A260/A280測(cè)定蛋白濃度，將抗原溶液稀釋到8.333mg/mL，加等量的弗氏佐劑乳化，使抗原溶液乳化均勻。

2.2 免疫

無(wú)菌取1.5mL的豬附紅細(xì)胞體12 000r/min離心10min，棄掉上清液后，加入等量的生理鹽水重懸附紅細(xì)胞體，多次洗滌以后，再加入等體積弗氏佐劑均勻混合。利用磁力攪拌器使得豬附紅細(xì)胞體懸液、弗氏佐劑乳化均勻，抗原含量為4.38×108/mL。在飼喂7d后，觀察小豬的精神狀態(tài)、測(cè)定其體溫、呼吸、脈搏等生理指標(biāo)，確定小豬健康后,采用肌肉注射的方式對(duì)小豬進(jìn)行多點(diǎn)免疫，首免后7d、15d加免2次，首免后每天測(cè)定體溫，以后隔3d測(cè)體溫，并觀察小豬的精神狀態(tài)和食欲情況，前腔靜脈采血，分離血清4℃保存，用行ELISA檢測(cè)血清中的抗體水平變化，當(dāng)抗體達(dá)到穩(wěn)定時(shí)，心臟采血，分離到的血清即為陽(yáng)性血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 間接ELISA檢測(cè)抗體

通過(guò)方陣試驗(yàn)，當(dāng)抗原濃度為80μg/mL，血清1∶40倍稀釋時(shí)P/N值最大，所以選擇該條件為最佳抗原，以最佳抗原濃度包被抗原，4℃過(guò)夜，用1%BSA封閉，加入1∶40稀釋后的血清，作用一定時(shí)間后加入1∶1 000稀釋的酶標(biāo)二抗，37℃作用45min，洗滌 5 次后，加 TMB，37℃顯色 15min，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450nm的吸光值。

2.4 動(dòng)物免疫后生理狀況以及抗體消長(zhǎng)情況

測(cè)定各階段的體溫，并觀察其生理狀況變化。按照上述確定的最佳包被濃度和血清稀釋倍數(shù)后進(jìn)行ELISA對(duì)免疫后的血清進(jìn)行檢測(cè)，觀察在不同的免疫時(shí)間后的抗體水平的變化。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 豬附紅細(xì)胞體免疫后體溫變化

觀察小豬精神狀態(tài)和飲食情況正常，進(jìn)行免疫后呼吸和脈搏均處于正常范圍內(nèi)。第1次免疫后小豬的體溫略升高，但在正常范圍內(nèi)波動(dòng)，以后幾次免疫后小豬的體溫?zé)o變化。由圖1可知，第1次免疫后豬的體溫變化不大。

3.2 脈搏和呼吸

進(jìn)行免疫后呼吸和脈搏均處于正常范圍內(nèi)。

3.3 抗體水平消長(zhǎng)

由圖2可知，免疫后每隔3d對(duì)豬采血分離血清，第1次免疫后，免疫豬和未免豬血清的OD值變化不大且值比較小，7d再免疫一次后，注射抗原免疫豬血清的OD值升高，第2次免疫后15d再免疫一次，免疫豬的抗體OD值逐漸達(dá)到較高的水平，對(duì)照豬血清的OD值變化不大。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清的效價(jià)，當(dāng)測(cè)得免疫豬血清的OD值與陰性對(duì)照豬的血清值之比（P/N）為7.76（P/N＞2.1），采集免疫豬血分離陽(yáng)性血清。

4 討論

豬附紅細(xì)胞體免疫豬后體液免疫水平和臨床指標(biāo)變化影響疫苗的研究,研究體液免疫也可以為該病的控制提供依據(jù),本研究中免疫后豬體溫變化不大,提示該免疫反應(yīng)很少伴隨發(fā)熱反應(yīng)。本次試驗(yàn)通過(guò)多次免疫,重復(fù)采樣,用ELISA方法檢測(cè)OD值,與對(duì)照進(jìn)行比較,當(dāng)免疫豬血清的OD值與陰性對(duì)照豬的血清值之比（P/N）為8.16（P/N＞2.1時(shí),采血制備出了免疫血清,該血清可以為豬附紅細(xì)胞體膠體金試紙的研制和ELISA試劑盒的研制提供陽(yáng)性血清,也可用于豬附紅細(xì)胞體黏附阻抑的研究。本研究也表明用滅活抗原免疫豬后可以產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)，這為豬附紅細(xì)胞體滅活疫苗的研制提供了前期參考。

[1] 李曉云,賈杏林,石德時(shí),等.豬附紅細(xì)胞體的體外連續(xù)培養(yǎng)[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008,39(8):1142-1146.

[2] 舍 英,杜躍峰,侯金鳳,等.附紅細(xì)胞體病的研究現(xiàn)狀[J].中國(guó)人獸共患病雜志,1995,(1):49-50.

[3] Doyle,L.P.A rickettsia-like or anaplasmosis-like disease in swine[J].J Am Vet Ass,1932,(8):668-671.

[4] Schilling V.Eperythrozoon coccoides,eine neue durch Splenektomie aktivierbare Dauerinfektion der weissen Maus[J].Kiln Wochenschr,1928:1854-1855.

[5] 唐 麗,李曉云,賈杏林.豬附紅細(xì)胞體分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2013,40(7):81-83.

[6] 賈杏林,張武林,李曉云.豬附紅細(xì)胞體致病機(jī)理的研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2010,37(5):149-151.

[7] 唐 麗,夏雨婷,賈杏林,等.兔抗豬附紅細(xì)胞體陽(yáng)性血清的制備研究[J].湖南畜牧獸醫(yī),2014,(1):13-14.

[8] 劉芳寧,楊增岐,張淑霞.附紅細(xì)胞體病病原學(xué)研究概況[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2003,24(3):31-34.

[9] 王占偉，邵國(guó)青，陳笑娟.動(dòng)物抗血清及其制備技術(shù)要點(diǎn)與應(yīng)用進(jìn)展[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2009,21(7):149-152.

S855.9

A

1006-4907（2014）05-0019-03

10.3969/j.issn.1006-4907.2014.05.009

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性試驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目（XCX13110）。

周 偉(1991～)，男，湖北洪湖人，在讀本科生?！ㄓ嵶髡撸嘿Z杏林(1970～)，男，教授，研究領(lǐng)域?yàn)閯?dòng)物輸血與血液病，E-mail:jxl1709@yahoo.com.cn。

2014-08-15