豬回腸炎免疫反應及免疫保護研究進展

程蘭玲，李俊輝，張 偉，賀 筍

（天康生物制藥有限公司，新疆 烏魯木齊 830011）

豬回腸炎 (Porcine proliferative enteropathy，PPE)是由一種重要的革蘭氏陰性胞內(nèi)勞森菌(Lawsonia Intracellularis，LI)引起，以回腸和結(jié)腸隱窩內(nèi)未成熟的腸細胞發(fā)生腺瘤樣增生為主要病理特征的接觸性腸道傳染病，主要引起4～20周齡的生長育肥豬出現(xiàn)腹瀉、貧血、食欲下降和生長緩慢等臨床癥狀。潛伏期一般為 2～3周。是在各種養(yǎng)殖條件下均可出現(xiàn)的一種世界性疾病[1]。

1 胞內(nèi)勞森菌的感染研究

1.1 組織毒感染

胞內(nèi)勞森菌是一種胞內(nèi)寄生細菌，豬感染發(fā)病后影響農(nóng)場的生產(chǎn)力和養(yǎng)殖效益。在野外條件下，細菌活化的精確分子機制和PPE發(fā)生所需的環(huán)境條件仍然是未知的。Boutrup等人[2]通過實驗性感染5周齡豬108CFU/mL的組織毒（刮取感染的腸黏膜），研究了早期發(fā)病機制。研究結(jié)果表明，感染后12 h，細菌感染小腸上皮細胞；感染后36 h形成離散灶，感染第5日（5 dpi，days post-infection）， 在重度感染隱窩周圍的固有膜中可以檢測到細菌。

1.2 細胞內(nèi)培養(yǎng)物感染

Macintyre等人[3]用2×108CFU/mL的細胞內(nèi)純培養(yǎng)物感染7周的仔豬，一半的感染動物表現(xiàn)出隱窩上皮增生，在感染第7日的隱窩上皮細胞之間有嗜中性粒細胞浸潤，但是在隱窩固有層沒有明顯的炎癥反應。感染第11日，在增生隱窩上皮細胞的細胞質(zhì)和固有層的單核細胞胞漿中檢測到大量的胞內(nèi)勞森菌。

雖然從感染第5日開始就在黏膜固有層單核細胞中檢測到細菌，但是在感染第11日沒有明顯的炎癥跡象，這表明先天性和適應性免疫反應要么是延遲的，要么是非常溫和的。在感染的早期，胞內(nèi)勞森菌避開了先天性免疫細胞和細胞因子的直接作用，進入細胞內(nèi)的細菌在小腸腔內(nèi)繁殖，在共生競爭中生存，并穿過黏液屏障感染宿主細胞。

2 不同感染時期免疫應答

2.1 感染后1～14 d，胞內(nèi)勞森菌感染引起的早期黏膜免疫應答

豬回腸炎主要有豬小腸腺瘤病（Porcine intestinal adenomatosis,PIA）和增生性出血腸?。≒roliferative haemorrhagic enteropathy,PHE）兩種不同的形式。在PIA與PHE兩種形式的回腸中，通過顯微鏡均可觀察到未成熟細胞增殖、杯狀細胞缺失和正常的隱窩細胞分化紊亂等顯微結(jié)構(gòu)改變。PHE形式的回腸中，還有黏膜IgA滴度和細胞因子的產(chǎn)生延遲，這可能有助于細菌向固有層的擴散[4]。先天性和適應性免疫反應被延遲或非常溫和，可能是由于細菌的免疫抑制作用。感染胞內(nèi)勞森菌5 d后，在重度感染隱窩周圍的固有膜中檢測到細菌；感染11 d后，在增生隱窩上皮細胞的胞漿和固有層單核細胞的胞質(zhì)中可見大量的胞內(nèi)勞森菌。在PHE形式的回腸中，急性回腸炎的主要特征是炎癥和黏膜出血，巨噬細胞和中性粒細胞浸潤并分泌炎性細胞因子進入固有層，導致動物的特征性癥狀和死亡[5]。

2.2 感染后14～42 d，發(fā)病中期胞內(nèi)勞森菌感染產(chǎn)生的免疫反應

感染14～25 d，細胞內(nèi)感染胞內(nèi)勞森菌的豬小腸腺瘤病形式的黏膜免疫反應主要表現(xiàn)為感染高峰期未成熟細胞過度增殖，杯狀細胞缺失、巨噬細胞和樹突狀細胞增加的微觀變化。

感染胞內(nèi)勞森菌后，從5～10 d時TNFα分泌增加，感染10～20 d時IFNγ、IL-6分泌增加；第20日時，抗炎細胞因子IL-4和TGFβ水平降低，第25日血清中IL-10水平降低[6]。細胞因子以 IFNγ、TNFα和IL-6分泌增加為主，IL-10，IL-4和TGFβ的血清濃度降低。

盡管IL-10、IL-4和TGFβ濃度降低，但是局部體液免疫反應被激活，感染15 d后特異性IgA分泌增加，在感染高峰的末期，免疫反應的調(diào)節(jié)臂開始啟動，感染20 d后血清中分泌TGFβ；感染25 d后分泌IL-8和IL-10。當感染第42日時，感染消退，黏膜固有層CD3+細胞明顯減少[7]。

到感染第15日，細菌在小腸和大腸擴散，回腸、盲腸、結(jié)腸以及空腸上皮細胞增生。在此期間，在回腸和空腸固有層、十二指腸、結(jié)腸、盲腸和直腸的隱窩細胞的管腔和胞漿中，以及近端結(jié)腸黏膜下層的淋巴結(jié)中都檢測到了細菌抗原。這些發(fā)現(xiàn)表明，胞內(nèi)勞森菌能夠在不受免疫系統(tǒng)約束的情況下在腸黏膜上傳播。在此期間，細菌被固有層的抗原提呈細胞(antigen presenting cell,APC)吸收，并被淋巴組織中的淋巴細胞提呈，從而引發(fā)抗原特異性的適應性免疫反應[8]。感染第19～24天，空腸黏膜組織病理學增加明顯，到感染第29天，大多數(shù)細菌從腸上皮細胞被清除，細菌抗原主要在固有層的單核細胞的細胞質(zhì)中被檢測到[9]。

從感染第35～42天，在感染消退的腸切片中沒有檢測到組織學損傷或胞內(nèi)勞森菌抗原。在感染42 d后，感染消退的特點是固有層CD3+細胞數(shù)量顯著減少，絨毛中CD8+細胞明顯減少[8]。此外，MHC-II染色顯示，在感染42 d后，部分固有層的MHC-II+染色總量少?？傊@些數(shù)據(jù)表明適應性免疫反應至少被延遲到感染后14 d，這可能有助于細菌的增殖和擴散到整個腸道[5]。

誘導后天免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的細胞免疫和體液免疫，分別通過IFNγ分泌細胞和IgA反應的升高來呈現(xiàn)。在感染的后半段，TGFβ和IL-10水平升高，這兩種細胞因子在抑制過度炎癥、下調(diào)炎癥促進因子，以及促進腸上皮完整性方面起著重要的調(diào)節(jié)作用。這些數(shù)據(jù)表明，要想成功地解決胞內(nèi)勞森菌感染，需要充分和及時地激活炎癥促進因子和調(diào)節(jié)性細胞因子，以提供免疫保護[6]。

3 感染后免疫保護

3.1 疫苗免疫

目前，有兩種已經(jīng)注冊的針對胞內(nèi)勞森菌的疫苗，用于預防豬場的豬回腸炎疾病。第一個注冊疫苗是某某格公司的產(chǎn)品，是一種活的細菌分離物B3903，在mccoy細胞中傳20～40代，使其致弱無毒[10]。一項研究結(jié)果表明，與未接種疫苗的對照組相比，接種腸道疫苗的豬在接受強毒性細菌攻擊時，只受到部分保護，腸道損傷明顯減少，沒有臨床癥狀，日增重也較為明顯。弱毒表現(xiàn)為細菌細胞代謝和毒力基因的下調(diào)[11]。

市場上第二種可用于治療胞內(nèi)勞森菌的疫苗是某公司的產(chǎn)品，它是由滅活的全細胞細菌與由礦物質(zhì)油和α-生育酚（維生素E）組成的佐劑配制而成。一項研究表明，對22～25 d斷奶前仔豬免疫接種滅活疫苗，然后用感染性細菌攻毒[12]，可以顯著提高血清抗體滴度，細菌排泄物減少15倍，減少了回腸的微小損傷，保持了腸道的完整性。

3.2 疫苗試驗療效評估

Jacobs等[13]通過兩項試驗性接種胞內(nèi)勞森菌疫苗，評估其使用效果，組Ⅰ是在試驗性感染條件下，采用皮內(nèi)注射胞內(nèi)勞森菌滅活疫苗與口服市售的胞內(nèi)勞森菌活疫苗的方法，分別單獨免疫3周齡豬，7周齡攻毒感染，攻毒后2 d觀察結(jié)果；組Ⅱ是在田間條件下，采用PCV混合的胞內(nèi)勞森菌皮內(nèi)注射疫苗的方法免疫81～129日齡豬，24周齡時感染攻毒，25周齡剖殺，并分別設置未免疫組作為陰性對照組。感染攻毒后，通過臨床癥狀、平均日增重、排出物及肉眼與顯微微觀免疫組織的回腸損傷評分。在田間試驗研究中，死亡率與關(guān)鍵性能參數(shù)評估超過8個月時間。研究結(jié)果顯示，胞內(nèi)勞森菌皮下注射疫苗與混合PCV皮下注射免疫疫苗，無論是單獨免疫還是混合免疫，對于胞內(nèi)勞森菌的感染都誘導了明顯的保護作用。與陰性對照組相比，顯示出了更低的臨床得分及明顯的增重，減少了胞內(nèi)勞森菌的排放及肉眼可觀的回腸損傷。

3.3 疫苗免疫應答與效用

Guedes等[14]研究了豬致病性細胞分離株和商品活疫苗對豬的免疫應答的起始和持續(xù)時間、細胞介導和體液免疫反應。試驗采用4.4×109致病性細胞分離物的PHE/MN1-00，胞內(nèi)勞森菌致弱活疫苗株接種5周齡豬13周，每組各選1頭于感染22 d后接受安樂死，以確認是否感染。接種致病分離株2周后首次檢測到豬的體液免疫反應和細胞免疫反應；接種改良活疫苗組的豬分別檢測到5周和4周的免疫反應。接種13周后，仍有部分豬出現(xiàn)體液反應和細胞免疫反應。糞便脫落最初檢出時間為接種致病菌株1周后，持續(xù)時間為間歇性12周；接種活疫苗后2周，持續(xù)時間為間歇性9周。總之，受到致病菌株與活疫苗接種的豬均顯示了長期的胞內(nèi)勞森菌脫落和免疫反應。動物接種后1～4周的致病菌分離群中觀察到的持續(xù)性腹瀉與其他試驗研究的結(jié)果一致。另外一項研究也證實了疫苗免疫組沒有明顯的持續(xù)性腹瀉，并證實了疫苗的安全性[15]。

IFNγ是TH-1型T細胞介導的重要細胞因子，可由CD4+或CD8+T細胞等多種腸黏膜細胞分泌。趨化因子IL-8還能刺激吞噬細胞，促進血管生成，幫助受損黏膜修復。多種細胞因子通過對抗促炎細胞因子和維持腸上皮屏障的作用，在調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用，但這些T細胞與細胞因子是如何影響胞內(nèi)勞森菌的仍不清楚[16]。目前，在控制豬回腸炎方面仍然存在諸多挑戰(zhàn)，但是我們可以期待在不久的將來動物疾病防治會找到新方向，使養(yǎng)殖業(yè)獲得新發(fā)展。