烘烤期煙葉霉?fàn)€病的病原鑒定

曾婷英，顧鋼，張紹升

1福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福州市倉(cāng)山區(qū)上下店路15號(hào) 350002；2福建省煙草專賣局煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福州市北環(huán)中路133號(hào) 350003

烘烤期煙葉霉?fàn)€病的病原鑒定

曾婷英1，顧鋼2，張紹升1

1福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福州市倉(cāng)山區(qū)上下店路15號(hào) 350002；2福建省煙草專賣局煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福州市北環(huán)中路133號(hào) 350003

為明確烘烤期煙葉霉?fàn)€病病因和發(fā)病條件，進(jìn)行了病原菌分離培養(yǎng)、病原菌形態(tài)特征觀察、生長(zhǎng)溫度試驗(yàn)、致病性測(cè)定及病害發(fā)生條件觀察。結(jié)果表明：病原菌為米根霉（Rhizopus oryzae），煙葉變黃期烤房溫度達(dá)36～40℃，相對(duì)濕度75%～85%的條件下有利病菌的生長(zhǎng)和侵染。首次確認(rèn)烘烤期煙葉霉?fàn)€是由病原菌引起的一種新的侵染性病害，該病害命名為煙葉霉?fàn)€病（tobacco leaf mildew and rot）。

烘烤期；煙葉霉?fàn)€；米根霉

烤壞煙葉是煙葉烘烤中經(jīng)常出現(xiàn)的問(wèn)題，在有些煙區(qū)烤壞煙葉約占烤煙產(chǎn)量6.3%～14.2%,對(duì)煙農(nóng)和煙葉生產(chǎn)造成重大損失[1]?？緣臒熑~的基本類型有黑螞皮煙葉、烤紅煙葉、烤青煙葉、青痕煙葉、掛灰煙葉、黑糟煙葉、洇筋煙片煙葉、烤爛煙葉[2-3]。前7類烤壞煙葉的原因一般歸于煙葉品質(zhì)、采收技術(shù)、編煙和烤房裝煙密度不當(dāng)，烘烤期溫度和濕度控制不當(dāng)?shù)?；烤爛煙葉被認(rèn)為是由于烘烤變黃期溫度過(guò)低而濕度過(guò)高，腐爛細(xì)菌或真菌易滋生和侵染所致[3]。云南省報(bào)道紅花大金元煙葉在烘烤過(guò)程中發(fā)生葉柄霉變,認(rèn)為煙葉葉柄霉變是感染霉菌引起的[4]。盡管以上報(bào)道認(rèn)為煙葉烘烤期霉?fàn)€與病原菌侵染有關(guān)，但是，迄今為止未見(jiàn)有關(guān)煙葉烘烤期霉?fàn)€的病原菌鑒定的報(bào)道。近幾年在福建省部分烤煙生產(chǎn)區(qū)調(diào)查也發(fā)現(xiàn)了煙葉在烘烤變黃階段發(fā)生霉變爛葉現(xiàn)象，霉變破爛的煙葉基本喪失利用價(jià)值，個(gè)別烤房烘烤期煙葉霉變率達(dá)50%以上，給煙農(nóng)帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p失。為此，本研究進(jìn)行了烘烤期煙葉霉?fàn)€的病原鑒定研究和霉變條件觀察，以期為該病原菌防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

樣本取自福建省政和縣楊源鄉(xiāng)密集式烤房烘烤期間霉變煙葉?？緹熎贩N：紅花大金元。

1.2 癥狀和侵染觀察

肉眼觀察霉變煙葉癥狀，利用體視顯微鏡觀察霉層在煙葉上的分布和為害特征。用解剖針從霉變煙葉上挑取霉?fàn)钗锿ㄟ^(guò)光學(xué)顯微鏡觀察鑒定。開(kāi)烤后定期觀察烤房?jī)?nèi)煙草霉變過(guò)程和記錄溫度濕度的變化。

1.3 致病性測(cè)定

采用磨擦接種法將煙葉葉柄上的霉?fàn)钗锝臃N于正常成熟的紅花大金元煙葉的葉柄摘口上，于30 ℃下保濕培養(yǎng)，觀察葉柄霉變情況。

1.4 病原菌的分離培養(yǎng)

取霉變煙葉，在病健交界處剪?。?～5）mm×（2～3） mm的病組織，先置于70%乙醇中浸3～5 s，接著移入0.1%升汞液中浸3～5 min，再經(jīng)滅菌水中漂洗3遍，把組織移到馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA）平板上，每皿放4～5塊， 于25 ℃的恒溫箱中倒置培養(yǎng)，24 h后進(jìn)行病原菌純化。

1.5 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

用解剖針挑取病煙葉上的霉層和培養(yǎng)基上培養(yǎng)的霉層，置于載玻片的乳酚油中，制成臨時(shí)玻片標(biāo)本，于光學(xué)顯微鏡下觀察病原菌形態(tài)特征，根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]進(jìn)行病原菌種類鑒定。

1.6 病原菌生長(zhǎng)溫度測(cè)試

用打孔器打取直徑為6mm病原菌菌餅，接種于PSA平板中央，分別置于10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、27 ℃、30 ℃、32 ℃、36 ℃、39 ℃、41 ℃、43 ℃、45 ℃的溫度下恒溫培養(yǎng)，于24 h后觀察菌落生長(zhǎng)情況，每處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀

煙葉上烤后24 h之內(nèi)（變黃排濕前期）葉柄開(kāi)始發(fā)霉（圖1，A），煙葉變黃前期和中期是霉變期,透過(guò)烤房玻璃門可以看到煙葉葉柄和葉片上發(fā)生大量霉層 (圖1，B)。霉變從葉柄開(kāi)始發(fā)生（圖1，C）,逐漸向葉片主脈、側(cè)脈及葉片擴(kuò)展,導(dǎo)致葉片大面積腐爛（圖1，D），病組織表面布滿灰白色霉層（圖1，E）。在體視顯微鏡下，可以看到霉菌的菌絲和孢子囊。霉變煙葉外觀色澤淡暗、變黑，發(fā)出霉味，煙葉的韌性和彈性降低。

2.2 病害發(fā)生條件

溫度和濕度是烘烤期發(fā)生煙葉霉?fàn)€的重要條件。通過(guò)烘烤期煙葉霉變過(guò)程的觀察，病害在煙葉變黃排濕前期，烤房干球溫度32～33 ℃、相對(duì)濕度85%～92%病害開(kāi)始發(fā)生，在煙柄上陸續(xù)出現(xiàn)灰白色霉層；煙葉烘烤變黃中期，烤房溫度維持在35～38 ℃，相對(duì)濕度在75%～85%，最適宜米根霉的生長(zhǎng)和侵染，病害迅速擴(kuò)展蔓延。煙葉變黃后期烤房干球溫度38～39 ℃、相對(duì)濕度74%～80%，病害發(fā)展速度減緩?？痉?jī)?nèi)下層煙發(fā)病較輕，中層煙葉發(fā)病較重，上層煙葉霉變最嚴(yán)重。不同層煙葉發(fā)病程度差異主要與濕度有較大關(guān)系。在烘烤期的低溫調(diào)濕變黃階段，低層煙葉升溫排濕較快較早、葉際濕度較低，而上層煙葉濕度較大且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，這是導(dǎo)致上層煙葉發(fā)病嚴(yán)重的重要原因。

圖1 烘烤期煙葉霉?fàn)€病癥狀Fig. 1 Symptoms of tobacco mildew disease during flue-curing

2.3 病原菌種類鑒定

在PSA培養(yǎng)基上菌落疏松，菌絲初期灰白色后轉(zhuǎn)變成灰黑色，孢囊梗產(chǎn)生于菌絲上。孢囊梗直立或稍彎曲，束生，每束2～4株、較少單株或5株。孢囊?；啃纬少橘虢z，匍匐絲在基質(zhì)上擴(kuò)展蔓延并且產(chǎn)生新的孢囊梗束，孢囊梗壁光滑或稍粗糙，褐色，長(zhǎng)1019(210～2800）μm、直徑14(9～20) μm，頂部膨大形成囊軸和孢子囊（圖2，A-B）。孢子囊球形或近球形（圖2，C），囊軸橢圓形或近球形，淡褐色、直徑103（60～150）μm，囊托鍥形（圖2，D）。孢囊梗束基部形成假根，假根發(fā)達(dá)，指狀分枝或根狀，褐色（圖2，E）。孢囊孢子橢圓形或近球形，黃灰色，直徑6（4～10 ）μm（圖2，F(xiàn)）。菌絲表生，菌絲成熟后產(chǎn)生大量孢囊梗和孢子囊。孢子囊形成初期呈白色（圖2，G），成熟后黑色（圖2，H），直徑158（100～220）μm。

根據(jù)病原菌的形態(tài)特征，該病菌鑒定為米根霉（Rhizopus oryzaeWent et Geerl.）。

致病性測(cè)定結(jié)果,接種后煙柄在30 ℃下保濕培養(yǎng)3 d后即可產(chǎn)生霉層。通過(guò)病原鑒定和致病性測(cè)定，確定烘烤期煙葉霉?fàn)€是由根霉菌引起的一種新的侵染性病害，命名為煙葉霉?fàn)€?。╰obacco leaf mildew rot）

圖2 米根霉的形態(tài)特征Fig. 2 .Morphological characters of Rhizopus oryzae

2.4 病原菌生長(zhǎng)溫度測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌在15～43 ℃均可生長(zhǎng)，27℃以下或41℃以上菌絲生長(zhǎng)明顯減緩，在29～39℃菌落形成生長(zhǎng)良好，菌絲生長(zhǎng)旺盛，氣生菌絲多，32～39℃菌絲生長(zhǎng)最旺盛，并且形成大量孢子囊。10℃以下或45 ℃以上菌絲停止生長(zhǎng) （表1、圖3）。

米根霉（Rhizopus oryzae）生長(zhǎng)溫度測(cè)定結(jié)果證實(shí)，32～39 ℃最適宜該菌的生長(zhǎng)和繁殖。這一結(jié)果與烤房烘烤期煙葉霉?fàn)€的發(fā)生條件高度吻合。米根霉是一種高溫菌，在環(huán)境中普遍分布，通過(guò)氣流傳播。病菌分布于烤房?jī)?nèi)外的環(huán)境中，煙葉田間生長(zhǎng)期和采收后入烤之前的儲(chǔ)放期均可帶菌。煙葉葉柄有豐富的營(yíng)養(yǎng)和適宜的濕度，適合根霉菌孢子的生長(zhǎng)和定殖，入烤房前由于溫度的限制，病菌無(wú)法大量繁殖。開(kāi)烤后溫度和濕度一旦適合病原菌的生長(zhǎng)和侵染，病害就會(huì)爆發(fā)為害。

表1 溫度對(duì)米根霉菌落生長(zhǎng)的影響Tab. 1 Effect of temperature on the growth of Rhizopus oryzae colony

圖3 不同溫度培養(yǎng)的米根霉菌落Fig. 3 Colonies of Rhizopus oryzae cultured at various temperature levels

3 討論

研究結(jié)果首次證實(shí)烘烤期煙葉霉?fàn)€是由米根霉（Rhizopus oryzaeWent et Geerl.）引起的一種侵染性病害，該病害與其他烤壞煙葉最大的區(qū)別是由生物因子引起，可以通過(guò)對(duì)病原菌的防控而實(shí)現(xiàn)病害預(yù)防。據(jù)報(bào)道在田間采收前煙葉或編好的煙葉噴施百菌清、多菌靈或甲霜靈錳鋅，對(duì)紅花大金元煙葉烘烤期葉柄發(fā)霉有一定防治效果[4]，這一結(jié)果也證實(shí)病原菌侵染是烘烤期煙葉霉變的主要病因。但是,采用這一防治措施是否會(huì)造成農(nóng)藥殘留尚需進(jìn)一步研究。

煙葉霉變主要集中于倉(cāng)儲(chǔ)期的煙葉霉變研究，有報(bào)道由根霉 (Rhizopussp.) 引起的倉(cāng)儲(chǔ)期煙葉霉?fàn)€[6-7]。一般認(rèn)為在烤房烘烤的高溫條件下對(duì)侵染性病害具有抑制作用。本研究結(jié)果證實(shí)烘烤期煙葉霉變的病菌具有嗜高溫的特性，在32～39℃條件下病菌生長(zhǎng)最旺盛。煙葉變黃期溫度32～39 ℃ 和相對(duì)濕度在75%～85%的條件正適宜病菌大量繁殖和侵染，病害發(fā)生期短而擴(kuò)散速度快，在短時(shí)間內(nèi)能造成大量損失。

本文僅對(duì)紅花大金元煙葉烘烤期霉?fàn)€的病原進(jìn)行了鑒定和發(fā)病條件研究，下一步需要進(jìn)行更廣泛的調(diào)查研究。確定不同煙草品種對(duì)病害的抗性，探明病原菌的侵染來(lái)源，掌握病害發(fā)生規(guī)律，開(kāi)展藥劑篩選和無(wú)公害防治技術(shù)研究。

4 結(jié)論

根據(jù)研究結(jié)果確認(rèn)，福建省發(fā)生的烘烤期煙葉霉?fàn)€是一種新的侵染性病害。該病害的病原菌鑒定為米根霉（Rhizopus oryzaeWent et Geerl.）。適宜發(fā)病的溫度為32～40℃，相對(duì)濕度為75%～85%，煙草烘烤變黃期是病害的發(fā)生期。根據(jù)病害癥狀特點(diǎn)，將此病害命名為煙葉霉?fàn)€病（tobacco leaf mildew rot）。

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Identification of tobacco mildew pathogen which causes leaf rot during flue-curing

ZENG Tingying1, GU Gang2, ZHANG Shaosheng1
1 College of Plant Protection, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China;2 Fujian Institute of Tobacco Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China

Causes and disease-inducing conditions were investigated through pathogen isolation and culture, morphological identification,growth temperature and pathogenicity test. Results showed that the pathogen wasRhizopus oryzaewhose suitable growth and infection conditions being 36～40 ℃ and relative humidity 75%～85% during yellowing period. Leaf mildew and rot during flue-curing is then confirmed as a new infectious disease induced by pathogen named tobacco mildew disease.

flue-curing ; mildew and rot;Rhizopus oryzae

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.04.013

S432 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1004-5708（2014）04-0065-04

中國(guó)煙草總公司福建省公司科技項(xiàng)目2012[043]號(hào)

曾婷英（1989—）,碩士研究生, 主要研究方向:植物病理學(xué),Tel:0591-83789187,Email 523908869@qq.com

張紹升(1951—),教授,主要研究方向:植物病理學(xué),Tel：0591-83789187, Email: shaoshengzhang@126.com

2013-07-11