煙草NtSnRK2.1基因的克隆及其在非生物脅迫條件下的表達

張洪映，賈宏昉，張松濤，楊永霞，崔紅

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，煙草行業(yè)栽培重點實驗室，鄭州市文化路95號 450002

煙草NtSnRK2.1基因的克隆及其在非生物脅迫條件下的表達

張洪映，賈宏昉，張松濤，楊永霞，崔紅

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，煙草行業(yè)栽培重點實驗室，鄭州市文化路95號 450002

從普通煙草腺毛cDNA文庫中篩查煙草SnRK2基因的EST序列，以此序列為信息探針，通過電子克隆和RT-PCR的方法從煙草中克隆到一個包含1017 bp開放閱讀框、編碼338個氨基酸的cDNA序列，命名為NtSnRK2.1。生物信息學(xué)分析表明，NtSnRK2.1蛋白同時具有磷酸化絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸的活性。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，NtSnRK2.1與擬南芥、水稻和小麥等植物中受逆境脅迫誘導(dǎo)表達的直系同源基因高度同源。組織表達分析結(jié)果顯示，煙草NtSnRK2.1基因的組織表達差異較大，在根部的表達量最高，其次是葉片，莖部的表達量最低。脅迫處理下的基因表達分析結(jié)果表明，NtSnRK2.1受高鹽、高滲、低溫脅迫和ABA處理誘導(dǎo)表達，對各脅迫條件的應(yīng)答模式不同，其對各脅迫條件的敏感度為：高滲＞高鹽＞低溫＞ABA。

普通煙草；NtSnRK2.1；非生物脅迫；克??；表達分析

煙草(Nicotiana tabacumL.)是我國重要的經(jīng)濟作物，也是進行分子生物學(xué)和植物生理學(xué)等研究的重要模式植物，研究煙草非生物脅迫響應(yīng)的相關(guān)基因?qū)τ诮沂緹煵莸目鼓娣肿訖C制和改良煙草抗逆性具有重要意義。植物體內(nèi)蛋白質(zhì)的可逆磷酸化是其在逆境條件下能量代謝和信號傳遞中的重要反應(yīng)，其中，蛋白磷酸化過程由蛋白激酶催化完成[1]。蔗糖非發(fā)酵相關(guān)蛋白激酶家族2 (SnRK2, SNF1-related protein kinase 2)是一類植物專一性蛋白激酶。研究表明，SnRK2基因家族成員廣泛參與植物的逆境應(yīng)答反應(yīng)，且各成員功能各異。在植物中第一個分離得到的SnRK2成員是小麥PKABA1基因，來源于ABA處理的小麥胚胎cDNA文庫[2]，PKABA1在干旱、低溫和鹽脅迫條件下可以上調(diào)表達[3]。對小麥TaSnRK2.4、TaSnRK2.7和TaSnRK2.8的抗逆性研究發(fā)現(xiàn)，三個基因以不同的調(diào)控方式增強植物的非生物脅迫抗性[4-6]。對擬南芥SnRK2家族的研究發(fā)現(xiàn)，AtSnRK2.2、AtSnRK2.3、AtSnRK2.6、AtSnRK2.7和AtSnRK2.8成員受ABA誘導(dǎo)激活，所有的擬南芥SnRK2成員均不受冷處理誘導(dǎo)，但是除AtSnRK2.1之外的所有SnRK2成員均受高鹽和甘露醇誘導(dǎo)激活[7-9]。擬南芥SnRK2.4和SnRK2.10基因的功能研究發(fā)現(xiàn)，其主要是通過維持根系的正常生長發(fā)育增強植物的抗鹽脅迫能力[10]。在水稻中分離到的10個SnRK2成員(SAPK1-10)均可以被滲透脅迫誘導(dǎo)表達，其中有三個基因SAPK8-10可以被ABA激活[11]。在大豆中克隆的第一個SnRK2成員GsAPK基因，受ABA誘導(dǎo)激活，能夠顯著增強植物的抗鹽脅迫能力[12]。目前在煙草中未見該家族功能的報道。

本研究從普通煙草腺毛cDNA文庫中篩查煙草SnRK2的EST序列信息，以獲得的SnRK2 EST序列(種子序列)為信息探針，通過電子克隆的方法進行電子拼接和延伸，利用RT-PCR技術(shù)得到煙草SnRK2基因的cDNA序列，通過分析SnRK2基因?qū)Σ煌婢趁{迫條件的應(yīng)答模式，揭示其在各非生物脅迫條件下的應(yīng)答機制，為利用SnRK2基因改良普通煙草的抗逆境脅迫能力提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為普通煙草品種K326，植株培養(yǎng)在16 h/8 h (光/暗)周期的生長培養(yǎng)箱中，溫度為25℃，相對濕度60%。

播種出苗后培養(yǎng)至3～4片真葉，挑選大小一致的幼苗移至沙培育苗盤中，Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)至五葉期，進行脅迫處理，處理方式包括四種：250 mmol L-1NaCl溶液進行高鹽脅迫；20% PEG-6000對煙草幼苗進行滲透脅迫；在4℃下進行低溫脅迫；100 μmol L-1的ABA噴灑煙草幼苗，同時用無離子水培養(yǎng)的幼苗作為對照。在脅迫前及脅迫處理后1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h分別采收葉片，同時收集對照幼苗的根、莖和葉片做基因的組織表達分析。經(jīng)液氮速凍后，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 NtSnRK2基因的克隆

1.2.1 NtSnRK2基因的電子克隆

篩查本實驗室構(gòu)建的煙草腺毛cDNA文庫[13]，選取煙草SnRK2 EST序列作為信息探針(種子序列)，應(yīng)用NCBI網(wǎng)站的Blast程序搜索煙草EST序列數(shù)據(jù)庫。利用DNAstar軟件中的Seqman程序?qū)⑺阉鞯降腅ST序列與種子序列進行拼接和比對，組裝成重疊群(contig)，以contig序列作為信息探針在煙草EST數(shù)據(jù)庫中繼續(xù)進行檢索、拼接和延伸序列，重復(fù)此過程至無新的EST序列檢出。最終獲得煙草SnRK2的電子延伸序列。

1.2.2 NtSnRK2基因的分離

總RNA提取按照Invitrogen TRizol Reagent說明書進行。反轉(zhuǎn)錄程序參照Invitrogen公司的M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒說明書進行。

應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件在NtSnRK2基因電子延伸序列的ORF區(qū)兩側(cè)設(shè)計RT-PCR擴增引物(F：5’-CCCTTGATTATGGAGCGTTA-3’，R：5’-TACAGCGCACTACACGTTCA-3’)。將 PEG 處理的7個時間點煙草cDNA等量混合物作模板，用高保真Pfu酶進行PCR擴增，回收純化目標(biāo)片段，將其連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后挑選陽性克隆進行測序驗證。

1.3 序列分析方法

應(yīng)用DNAStar軟件進行基因序列ORF區(qū)的查找、蛋白翻譯以及基因序列比對；利用SMART程序和ScanProsite (au.expasy.org/prosite)網(wǎng)站預(yù)測蛋白特性；蛋白質(zhì)的分子量和等電點由Compute pI/MW程序進行計算；利用TMPRED軟件(http://ch.embnet.org/cgibin/TMPRED)進行跨膜預(yù)測。

1.4 聚類分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫下載擬南芥、水稻、小麥及玉米SnRK2家族10個基因成員的氨基酸序列，通過ClustalW網(wǎng)站進行序列的多重比對分析，然后應(yīng)用PHYLIP程序進行聚類分析。

1.5 實時定量RT-PCR和半定量RT-PCR檢測

應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計擴增引物(F：5’-CTGTAGGGACGCCTGCTTATG-3’，R：5’-TGGACTTGTTCGGGGATTGA-3’)。以煙草組成型表達基因L25(F：5’-GCTTTCTTCGTCCCATCA-3’，R：5’-CCCCAAGTACCCTCGTAT-3’)作為內(nèi)參。按照Invitrogen公司的RealMasterMix (SYBR Green)試劑盒說明書進行實時定量RT-PCR，每個樣品3次重復(fù)。

實時定量的實驗結(jié)果采用2-ΔΔCt算法[14]進行分析，假設(shè)目的基因在脅迫處理下的表達量是對照(正常培養(yǎng))的N倍，N = 2-ΔΔCt，ΔΔCt = Treat(Ct樣品- CtL25) - CK(Ct樣品 - CtL25)。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草SnRK2基因的克隆與序列分析

以普通煙草腺毛cDNA文庫中得到的SnRK2 EST序列為信息探針，在NCBI煙草EST數(shù)據(jù)庫中搜索到30條高度同源序列，電子克隆后獲得一條長度為1306 bp的煙草SnRK2基因序列， RT-PCR擴增和測序證實得到序列與電子拼接結(jié)果一致。將該序列輸入到ORF Finder中，目標(biāo)片段長1182 bp，包含1個1017 bp的ORF區(qū)(158-1174 bp)，編碼338個氨基酸，分子量約43 kD，等電點(pI)為5.78。

Blast序列比對分析發(fā)現(xiàn)，克隆基因與已知同科植物SnRK2.1基因編碼的氨基酸序列高度同源(圖1)， 與番茄SAPK2-like(Solanum lycopersicum,XM_004237888)同源性達到92.0%，與馬鈴薯SnRK2.1(Solanum tuberosum, JX280911)同源性達到90.7%。表明這個新克隆的cDNA序列為煙草SnRK2家族基因成員，將該基因命名為NtSnRK2.1。

圖1 煙草NtSnRK2.1、馬鈴薯SnRK2.1和番茄SAPK2-like的氨基酸序列比對Fig. 1 Amino acid sequence comparison of tobacco NtSnRK2.1, potato SnRK2.1 and tomato SAPK2-like

2.2 NtSnRK2.1編碼產(chǎn)物的生物信息學(xué)分析

2.2.1 NtSnRK2.1的結(jié)構(gòu)域預(yù)測

應(yīng)用NCBI結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫進行保守域預(yù)測發(fā)現(xiàn)，NtSnRK2.1氨基酸序列的第4-260位之間存在絲氨酸/蘇氨酸激酶和酪氨酸激酶催化域，推測該蛋白同時具有催化絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸磷酸化的活性。其中第10-33位氨基酸是蛋白激酶ATP結(jié)合域信號、第119-131位氨基酸為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點信號，第123位為質(zhì)子接受位點。ScanProsite和SMART程序預(yù)測結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)NtSnRK2.1具備蛋白激酶超家族的特征基序，包括酪氨酸激酶磷酸化位點、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、蛋白激酶C磷酸化位點。此外，該蛋白存在N-豆蔻?；稽c(第134-139位AAR)和跨膜結(jié)構(gòu)域(第207-224位AAR)。因此，NtSnRK2.1編碼產(chǎn)物是典型的植物蛋白激酶。

2.2.2 NtSnRK2.1的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

利用TMPRED軟件對NtSnRK2.1基因編碼的氨基酸序列進行跨膜區(qū)預(yù)測，大于500分值為存在有意義的跨膜螺旋。TMPRED模型分析發(fā)現(xiàn)NtSnRK2.1蛋白包含多個跨膜螺旋區(qū)域(圖2)，其中包含2個可能性極高的跨膜螺旋：183-201位(i—o)存在1個強的由內(nèi)向外的跨膜螺旋，得分1302，180-198位(o—i)存在1個強的由外向內(nèi)的跨膜螺旋，據(jù)此推測該基因編碼的激酶是跨膜蛋白。

圖2 NtSnRK2.1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig. 2 Protein transmembrane domain of NtSnRK2.1

2.3 聚類分析

2.3.1 NtSnRK2.1基因的進化分析

擬南芥、玉米和水稻已發(fā)現(xiàn)10個SnRK2基因家族成員，其C端典型特征是氨基酸相對較短，具有一個富含天冬氨酸或谷氨酸(E/D)的酸性補丁結(jié)構(gòu)。根據(jù)C端結(jié)構(gòu)將SnRK2家族分為兩個亞族：SnRK2a (Subclass I和Subclass II)和SnRK2b (Subclass III)，其中SnRK2a亞族成員的C端富含天冬氨酸，而SnRK2b亞族成員中富含谷氨酸[15]。SnRK2 C端的酸性補丁結(jié)構(gòu)域與酶的激活、蛋白間的相互作用及ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)[16-17]。煙草NtSnRK2.1基因C端富含天冬氨酸，進化分析表明應(yīng)屬于SnRK2家族Subclass II亞族 (圖 3)。

圖3 NtSnRK2.1系統(tǒng)進化分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of NtSnRK2.1

2.3.2 NtSnRK2.1同源性分析與功能預(yù)測

將NtSnRK2.1基因與擬南芥、水稻、小麥、大豆、玉米、番茄和馬鈴薯同源基因的氨基酸序列進行進化分析(圖 4)，發(fā)現(xiàn)與煙草NtSnRK2.1同源關(guān)系最近的為同科植物番茄SAPK2-like(92%)和馬鈴薯StSnRK2.1(90.7%)，其次為大豆、小麥、水稻和玉米，同源關(guān)系最遠的為擬南芥。已報道的這些NtSnRK2.1同源基因都與植物逆境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)，例如擬南芥SnRK2.1基因受高鹽和高滲透脅迫誘導(dǎo)表達[7]，水稻SAPK2受冷、高鹽和高滲等逆境脅迫的誘導(dǎo)[11]，小麥PKABA1在低溫、干旱和鹽脅迫條件下上調(diào)表達[3]，玉米ZmSPK1為ABA、高鹽和高滲誘導(dǎo)的蛋白激酶[18]。

同源性分析的結(jié)果，進一步驗證了NtSnRK2.1功能保守域推測的結(jié)果，即所克隆的NtSnRK2.1基因?qū)儆跓煵軸nRK2家族基因，可能與其同源基因類似，具有抗逆境脅迫功能。

圖4 SnRK2.1的同源性分析Fig. 4 Homology analysis of SnRK2.1

2.4 NtSnRK2.1的表達特性

2.4.1 NtSnRK2.1的組織表達特性

煙草NtSnRK2.1基因的組織表達特性分析表明，在煙草的根、莖和葉均有表達，但組織間的表達差異較大，NtSnRK2.1基因在煙草根部的表達量最高，其次為葉片，莖部的表達量最低(圖5)。

圖5 NtSnRK2.1的組織表達分析Fig. 5 Tissue expression analysis of NtSnRK2.1

2.4.2 非生物脅迫下NtSnRK2.1的表達特性分析

半定量和實時定量的實驗結(jié)果均表明，煙草NtSnRK2.1基因廣泛參與了高滲、高鹽、低溫脅迫和ABA處理的應(yīng)答反應(yīng)（圖6）。當(dāng)煙草幼苗受到滲透脅迫時，NtSnRK2.1基因在脅迫后1 h迅速上升到對照(處理前)的27.9倍，而后急速下降，在脅迫24 h時，表達量回升至對照的19.8倍，隨后表達量逐漸降低。在鹽脅迫1 h 時，NtSnRK2.1表達量迅速升高（為對照的8.4倍），6 h時達到高峰，為對照的10.6倍，隨后表達量降低并維持在對照的2-4倍。當(dāng)煙草幼苗受到低溫脅迫(4℃)時，NtSnRK2.1基因的表達量持續(xù)升高至48 h時達到峰值，為對照的21.2倍，72 h時下降至對照的11.4倍。當(dāng)外源ABA誘導(dǎo)處理時，NtSnRK2.1的表達量較脅迫處理增幅不大，在最初的3個小時內(nèi)基本不變，而后開始上升，12 h達到高峰，為對照水平的2.8倍，24 h后開始逐漸下降，在72 h時表達量降至對照的1.5倍?？傊?，煙草NtSnRK2.1基因受高滲、高鹽、低溫脅迫和ABA誘導(dǎo)表達，且在四種誘導(dǎo)條件下的應(yīng)答模式不同，其對各誘導(dǎo)條件的敏感度為：高滲＞高鹽＞低溫＞ABA。

3 結(jié)論與討論

3.1 NtSnRK2.1的生物信息學(xué)分析

蛋白功能域預(yù)測發(fā)現(xiàn)NtSnRK2.1同時具有N-豆蔻?；稽cMYRISTYL和跨膜結(jié)構(gòu)域，這兩個功能域是植物在逆境脅迫下細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白間相互作用的關(guān)鍵位點[19-20]?？缒そY(jié)構(gòu)域預(yù)測NtSnRK2.1為跨膜蛋白，因而該蛋白可能在膜上有分布，推測NtSnRK2.1蛋白可能與小麥SnRK2[4-6]的亞細胞定位結(jié)果一致，在細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核均有分布。

圖6 煙草NtSnRK2.1基因?qū)Σ煌婢趁{迫處理的應(yīng)答模式Fig. 6 Response of NtSnRK2.1 gene to different stress treatment

SnRK2的系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示煙草NtSnRK2.1屬于SnRK2家族Subclass II亞族基因成員(圖3)，聚類結(jié)果顯示SnRK2基因家族分為三個亞族，各亞族同時包含擬南芥、水稻和玉米的SnRK2基因成員，此結(jié)果表明SnRK2基因家族成員的分化時間先于單子葉和雙子葉植物的分化時間。同源性比對結(jié)果表明，煙草NtSnRK2.1基因與同科植物同源基因的相似性高達90%以上，可見，SnRK2.1在茄科植物中是高度保守基因。

3.2 NtSnRK2.1的表達分析

擬南芥根部的SnRK2C基因能夠調(diào)控抗旱相關(guān)基因在滲透脅迫下過量表達[21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)煙草NtSnRK2.1基因在煙草根部的表達量最高，其次為葉片，在煙草莖部的表達量最低。考慮到SnRK2基因在蔗糖代謝中的重要作用，推測其抗逆機理可能是，蔗糖非發(fā)酵相關(guān)蛋白激酶家族2 (SnRK2)在逆境脅迫下在根部過量表達，降低根部細胞滲透勢，以增強根系對水分以及營養(yǎng)成分的吸收。煙草NtSnRK2.1基因的轉(zhuǎn)基因功能驗證實驗正在進行中。

煙草NtSnRK2.1基因的小麥、水稻、玉米和擬南芥同源基因同時受外源ABA誘導(dǎo)和多種逆境脅迫表達[3,7,11,18]?；虮磉_特性分析顯示，NtSnRK2.1受高滲、高鹽、低溫和ABA處理誘導(dǎo)，推測該基因是一種作用廣泛的脅迫應(yīng)答基因；此外，NtSnRK2.1對各脅迫條件的應(yīng)答模式不同，其對各脅迫條件的敏感度為：高滲＞高鹽＞低溫＞ABA。

植物中存在ABA依賴型和非ABA依賴型兩種信號傳遞途徑同時調(diào)控滲透脅迫誘導(dǎo)基因的表達[22]。一些非ABA依賴型抗逆基因的啟動子區(qū)同時含有干旱脅迫應(yīng)答元件和ABA應(yīng)答元件，雖然這些基因不依賴ABA誘導(dǎo)表達，能夠直接響應(yīng)干旱等逆境因子，但仍能夠?qū)ν庠碅BA響應(yīng)[23-24]。同樣，NtSnRK2.1在高滲、高鹽、低溫脅迫下迅速響應(yīng)，而在受外源ABA誘導(dǎo)時，其表達量的最高值僅為對照的2.8倍，據(jù)此推測煙草NtSnRK2.1基因?qū)Ψ巧锩{迫條件的快速應(yīng)答可能不依賴于細胞內(nèi)的ABA作用，該結(jié)論還需要對NtSnRK2.1基因啟動子進行研究證實。

NtSnRK2.1受多種非生物脅迫的誘導(dǎo)表達，一方面表明植物體內(nèi)各種逆境信號傳遞途徑間可能存在串?dāng)_，另一方面也說明該基因可能存在于復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的交叉點，是一種作用廣泛的抗逆基因，因此對于提高作物的抗逆性具有重要的意義。

[1]Knight H. Calcium signaling during abiotic stress in plants[J]. Int Rev Cytol, 2000, 195: 269-325.

[2]Anderberg R J, Walker-Simmons M K. Isolation of a wheat cDNA clone for an abscisic acid-inducible transcript with homology to protein kinases [J]. Proc Natl Acad Sci USA,1992, 89: 10183-10183.

[3]Holappa L D, Walker-Simmons M K. The wheat abscisic acid-responsive protein kinase mRNA PKABA1, is upregulated by dehydration, cold temperature, and osmotic stress [J]. Plant Physiol, 1995, 108: 1203-1210.

[4]Mao Xinguo, Zhang Hongying, Tian Shanjun, et al.TaSnRK2.4, a SNF1-type serine/threonine protein kinase of wheat (Triticum aestivum L.), confers enhanced multistress tolerance in Arabidopsis [J]. J Exp Bot, 2010, 61: 683-696.

[5]Zhang Hongying, Mao Xinguo, Jing Ruilian, et al.Characterization of a common wheat (Triticum aestivum L.)TaSnRK2.7 gene involved in abiotic stress responses [J]. J Exp Bot, 2011, 62: 975-988.

[6]Zhang Hongying, Mao Xinguo, Wang Chengshe, et al.Overexpression of a common wheat gene TaSnRK2.8 enhances tolerance to drought, salt and low temperature in Arabidopsis [J]. PLoS ONE, 2010, 5: e16041.

[7]Boudsocq M, Barbier-Brygoo H, Lauriere C. Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana [J]. Biological Chemistry, 2004, 279: 41758-41766.

[8]Boudsocq M, Droillard M J, Barbier-Brygoo H, et al.Different phosphorylation mechanisms are involved in the activation of sucrose non-fermenting 1 related protein kinases 2 by osmotic stresses and abscisic acid [J]. Plant Mol Biol, 2007, 63: 491-503.

[9]Xie Tian, Ren Ruobing, Zhang Yuanyuan, et al. Molecular mechanism for inhibition of a critical component in the Arabidopsis thaliana abscisic acid signal transduction pathways, SnRK2.6, by protein phosphatase ABI1[J]. J Biolo Chem, 2012, 287: 794-802.

[10]McLoughlin F, Galvan-Ampudia CS, Julkowska MM, et al.The Snf1-related protein kinases SnRK2.4 and SnRK2.10 are involved in maintenance of root system architecture during salt stress [J]. Plant J, 2012, 72: 436-449

[11]Diedhiou C J, Popova O V, Dietz K J, et al. The SNF1-type serine-threonine protein kinase SAPK4 regulates stressresponsive gene expression in rice [J]. BMC Plant Biol,2008. 8: 49.

[12]Yang Liang, Ji Wei, Gao Peng, et al. GsAPK, an ABA-activated and calcium-independent SnRK2-type kinase from G. soja, mediates the regulation of plant tolerance to salinity and ABA stress [J]. PLoS ONE, 2012, 7: e33838.

[13]Cui Hong, Zhang Songtao, Yang Huijuan, et al. Gene expression profile analysis of tobacco leaf trichomes [J].BMC Plant Biol, 2011, 17: 76.

[14]Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2－△△CTmethod [J]. METHODS, 2001, 25: 402-408.

[15]Halford N G, Hardie D G. SNF1-related protein kinases:global regulators of carbon metabolism in plants [J]. Plant Molecular Biology, 1998, 37: 735-748.

[16]Huang J F, Teyton L, Harper J F. Activation of a Ca(2+)-dependent protein kinase involves intramolecular binding of a calmodulin-like regulatory domain [J]. Biochemistry,1996, 35: 13222-13230.

[17]Kobayashi Y, Yamamoto S, Minami H, et al. Differential activation of the rice sucrose nonfermenting1-related protein kinase 2 family by hyperosmotic stress and abscisic acid [J]. Plant Cell, 2004, 16: 1163-1177.

[18]Zou Huawein, Zhang Xiuhai, Zhao Jiuran, et al. Cloning and characterization of maize ZmSPK1, a homologue to nonfermenting1-related protein kinase2 [J]. African Journal of Biotechnology, 2006, 5: 490-496.

[19]Podel S, Gribskov M. Predicting N-terminal myristoylation sites in plant proteins [J]. BMC Genomics, 2004, 5: 37-51.

[20]Ishitani M, Liu J P, Halfter U, et al. SOS3 function in plant salt tolerance requires N-myristoylation and calcium binding [J]. Plant Cell, 2000, 12: 1667-1677.

[21]Umezawa T, Yoshida R, Maruyama K, et al. SRK2C, a SNF1-related protein kinase 2, improves drought tolerance by controlling stress-responsive gene expression inArabidopsis thaliana[J]. PNAS, 2004, 101: 17306-17311.

[22]Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. Molecular responses to dehydration and 1ow temperature: differences and crosstalk between two stress signaling pathways [J]. Curr Opin Plant Biol, 2000, 3: 217-223.

[23]Bray E A. Molecular responses to water deficit [J]. Plant Physiol, 1993, 103: 1035-1040.

[24]Shinozaki K, Yamaguchi-shinozaki K. Gene expression and signal transduction in water stress response [J]. Plant Physiol, 1997, 115: 327-334.

Cloning and expression ofSnRK2.1gene under abiotic stress

ZHANG Hongying, JIA Hongfang, ZHANG Songtao, YANG Yongxia, CUI Hong
Key Laboratory of Tobacco Cultivation, College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China

One EST ofSnRK2was screened from glandular trichome cDNA library of tobacco. Based on the EST sequence,NtSnRK2.1was isolated from tobacco (Nicotiana tabacumL.) byin silicocloning and RT-PCR.NtSnRK2.1includes an open reading frame (ORF)of 1017 bp and encodes 338 deduced amino acid residues (AAR) with a calculated molecular mass of 43 kDa and a predicted pI of 5.78.Scansite analysis indicated that NtSnRK2.1 contained potential serine/threonine protein kinase activities like other SnRK2 family members.Phylogenetic analysis suggestedNtSnRK2.1was high homologous to its orthologous genes from Arabidopsis, rice and wheat, which were also induced by abiotic stresses. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and quantitative real-time PCR (qRT-PCR)was used to determine expression patterns ofNtSnRK2.1in tobacco. Results revealed thatNtSnRK2.1expressed most strongly in tobacco roots, more in leaves, and marginally in stems. Expression patterns under abiotic stress responses suggested thatNtSnRK2.1was involved in response to NaCl, PEG, cold stresses and ABA treatment, with significant different responsive profiles. The sensitivity degrees ofNtSnRK2.1responding to four treatments was in the order of hyperosmolality ＞ high salinity ＞ low temperature (4℃ ) ＞ abscisic acid.

Nicotiana tabacum; NtSnRK2.1; abiotic stress; cloning; expression analysis

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.04.018

Q81 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1004-5708（2014）04-0094-07

中國煙草總公司特色優(yōu)質(zhì)煙葉開發(fā)重大專項濃香型項目（110201101001 TS-01），國家煙草局資助（110200902045）

張洪映（1982—），博士，講師，從事煙草生物技術(shù)研究，Email: Zhangying198215@163.com

崔紅（1966—），博士，教授，從事煙草生物技術(shù)研究，Email: cuihonger_13@163.com

2013-07-08