煙草半胱氨酸蛋白酶抑制劑（CPI）基因家族的克隆及組織表達譜分析

林世鋒，元野，任學良，鄒頡，黎瑞源，郭玉雙，趙杰宏，王仁剛

1貴州省煙草科學研究院，煙草行業(yè)分子遺傳重點實驗室，貴州貴陽 550081；2黑龍江省煙草科學研究所，牡丹江 157011

煙草半胱氨酸蛋白酶抑制劑（CPI）基因家族的克隆及組織表達譜分析

林世鋒1，元野2，任學良1，鄒頡1，黎瑞源1，郭玉雙1，趙杰宏1，王仁剛1

1貴州省煙草科學研究院，煙草行業(yè)分子遺傳重點實驗室，貴州貴陽 550081；2黑龍江省煙草科學研究所，牡丹江 157011

運用生物信息學方法，結(jié)合RT-PCR和SMART RACE技術(shù)從煙草（Nicotiana tabacum）中克隆了4個CPI基因的全長cDNA序列，分別命名為NtCPI1、NtCPI2、NtCPI3和NtCPI4， GenBank登陸號分別為KF057988、KF057989、KF057990和KF057991?；蛐蛄蟹治霰砻?個基因分別編碼98、98、120和123個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，都具有CPI反應位點的保守基序GG、QXVXQ和A/PW，同時具有植物CPI所特有的LARFAV基序，其中NtCPI3和NtCPI4的N端還包含一段27個氨基酸殘基組成的信號肽。實時熒光定量PCR試驗表明，4個基因的組織表達譜很廣，在根、莖、葉和芽組織中都有表達。研究結(jié)果為進一步研究半胱氨酸蛋白酶抑制劑在植物中的生理功能奠定了基礎(chǔ)。

煙草；半胱氨酸蛋白酶抑制劑；基因家族；克?。唤M織表達譜

半胱氨酸蛋白酶抑制劑（Cysteine proteinase inhibitor，CPI），也稱巰基蛋白酶抑制劑，是一類廣泛存在于動植物體內(nèi)的蛋白超家族，其生理作用是與巰基蛋白酶相互作用和制約達到動態(tài)平衡，調(diào)節(jié)機體內(nèi)蛋白酶活性，進而制約蛋白質(zhì)代謝，阻止不良的蛋白水解作用[1-2]。在植物中，CPI參與調(diào)控植物體胚胎發(fā)育[3-4]、種子萌發(fā)[5-6]、幼苗生長[7]、果實成熟[8]以及組織分化衰老[9-10]和細胞程序性死亡[11-12]等機制。近年來，研究發(fā)現(xiàn)植物CPI在提高作物對病蟲害的抗性[13-15]以及緩解非生物脅迫造成的損傷[16-17]等方面具有重要作用，因而研究和利用CPI基因，闡述該基因的作用機理，對提高我國作物品質(zhì)和產(chǎn)量，開發(fā)綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)具有重大意義。

目前，已從水稻[18]、玉米[19]、小麥[20]、大豆[21]、番茄[13,15,22]等多種植物中克隆到CPI基因，它們在進化上高度保守，而煙草CPI基因序列尚未見報道。為此，本研究利用生物信息學方法，結(jié)合RT-PCR和SMART RACE技術(shù)，克隆了煙草CPI基因cDNA全序列；并運用RT-PCR方法，對其在煙草組織中的表達情況進行研究，以期為煙草CPI基因功能的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

分別收集煙草栽培品種K326（Nicotiana tabacumL. cv. K326）生根期幼苗的根、莖、葉和芽組織，液氮迅速冷凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取與cDNA第一鏈的合成

采用Trizol Reagent（Invitrogen公司）法提取總RNA。參照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。

1.2.2 CPI全長cDNA的克隆

以番茄CPI全長cDNA序列（登陸號：XM_004228432）為信息探針，在NCBI煙草EST數(shù)據(jù)庫中進行BLAST檢索，將檢索到的來自煙草品種K326的全部EST序列利用DNAMAN6.0軟件進行拼接，形成序列重疊群（Contig）。

根據(jù)獲得的重疊群序列設(shè)計各自基因3′RACE嵌套引物和5′RACE嵌套引物，利用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（TaKaRa公司）進行RACE擴增，分別獲得各個基因的3′端序列和5′端序列。再用DNAMAN軟件組裝以上序列，獲得全長cDNA序列信息，分別設(shè)計合成1對基因全長引物C1-F和 C1-R、C2-F和 C2-R、C3-F和 C3-R、C4-F和C4-R，以合成的煙草品種K326 cDNA第一鏈為模板，進行PCR擴增，獲得4個煙草CPI基因的全長cDNA序列。

表1 引物序列及預期片段大小Tab. 1 Sequence of primers and preproduction length

表1 （續(xù)）

1.2.3 CPI基因的生物信息學分析

應用ORF Finder（ http: //www. ncb.i nlm. nih.gov/gorf/gor.f html）程序確定開放閱讀框（ORF）；通過 NCBI 上 的 BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）進行序列相似性檢索；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析采用SMART 程序（http://smart.embl-heidelberg.de/）；運用DNAMAN 6.0、ClustalX 2.0和MEGA4.0軟件進行氨基酸序列比對和進化樹分析。

1.2.4 CPI的DNA序列克隆

采用CTAB法[23]從新鮮幼嫩的煙草葉片中提取基因組DNA。利用基因全長引物進行擴增、克隆和測序。

1.2.5 實時熒光定量PCR

根 據(jù)NtCPI1、NtCPI2、NtCPI3和NtCPI4的cDNA序列設(shè)計特異引物C1-rF和C1-rR、C2-rF和C2-rR、C3-rF和C3-rR、C4-rF和C4-rR。選用煙草Actin基因（NTU60495）為內(nèi)參基因，并設(shè)計引物Actin-rF和Actin-rR。利用TaKaRa公司Taqman探針試劑盒在ABI Stepone Plus實時熒光定量PCR儀上進行RT-qPCR實驗，采用2-ΔΔCt相對定量法[24]分析各基因在煙草不同組織中的表達水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 NtCPI1、NtCPI2、NtCPI3和NtCPI4全長cDNA克隆及分析

以XM_004228432為信息探針，在煙草EST庫中進行檢索和重疊群分析，最終獲得4個重疊群。由此設(shè)計合成RACE引物進行擴增，獲得各自基因的3′端和5′端（圖1）。通過測序拼接，獲得各自基因的全長序列信息。經(jīng)ORF搜索以及其它植物來源CPI基因比對分析，確定各自基因具有完整的ORF。根據(jù)全長基因拼接序列設(shè)計引物，用RT-PCR方法，獲得全長cDNA序列（圖2），將其命名為NtCPI1、NtCPI2、NtCPI3和NtCPI4，并在GenBank注冊，基因登陸號分別為KF057988、KF057989、KF057990和KF057991（圖3）。

NtCPI1基因cDNA全長564 bp（不包含多聚腺苷酸尾），由36 bp的5′端非翻譯區(qū)（5′-UTR）、297 bp編碼區(qū)和231 bp的3′端非翻譯區(qū)（3′-UTR）組成，編碼98個氨基酸，預測分子量約為10.819 kD，等電點為5.83；NtCPI2基因cDNA全長593 bp，由84 bp的5′-UTR、297 bp編碼區(qū)和212 bp的3′-UTR組成，編碼98個氨基酸，預測分子量約為10.807 kD，等電點為5.43；NtCPI3基因cDNA全長655 bp，由51 bp的5′-UTR、363 bp編碼區(qū)和241 bp的3′-UTR組成，編碼120個氨基酸，預測分子量約為12.993 kD，等電點為9.44；NtCPI4基因cDNA全長573 bp，由60 bp的5′-UTR、372 bp編碼區(qū)和141 bp的3′-UTR組成，編碼123個氨基酸，預測分子量約為13.419 kD，等電點為10.01。

SMART分析發(fā)現(xiàn)，NtCPI1、NtCPI2、NtCPI3和NtCPI4基因編碼的多肽包含典型的CY superfamily保守功能結(jié)構(gòu)域，其中NtCPI3和NtCPI4基因編碼的多肽N端包含一段27個氨基酸殘基組成的信號肽，而NtCPI1和NtCPI2基因編碼的多肽不具有信號肽（圖3）。進一步分析發(fā)現(xiàn)，NtCPI1、NtCPI2、NtCPI3和NtCPI4成熟多肽具有植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑產(chǎn)生抑制活性所必須的一級結(jié)果：2個靠近N端的G、假定的反應域QXVXG和靠近C端的A/PW基序；并且存在典型的植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因家族高度保守的特征模式 [LVI]-[AGT]-[RKE]-[FY]-[AS]-[VI]-x-[EDQV]-[HYFQ]-N（圖3）。

圖1 煙草CPI基因的5′RACE 和3′RACE電泳結(jié)果Fig. 1 Electrophoresis analysis of 5′ RACE and 3′ RACE products of CPIs from Nicotiana tabacum

圖2 煙草CPI基因全長cDNA和基因組DNA的PCR 擴增結(jié)果Fig. 2 PCR Amplification of the full length cDNA and genomic DNA of CPIs from Nicotiana tabacum

圖3 煙草CPI基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸Fig. 3 Nucleotide and deduced amino acid sequences of CPIs from Nicotiana tabacum

經(jīng)氨基酸序列同源檢索，發(fā)現(xiàn)NtCPI1與番茄SlCPI1（XP_004228480）同源關(guān)系最近，一致性為98%；NtCPI2與蓖麻 RcCPI（XP_002523225）同源關(guān)系最近，一致性為80%；NtCPI3與番茄SlCPI3（XP_004250271）同源關(guān)系最近，一致性為79%；NtCPI4與番茄SlCPI4（XP_004239826）同源關(guān)系最近，一致性為70%（圖4）。系統(tǒng)進化分析顯示，從煙草中分離的CPI分為2組，其中NtCPI1和NtCPI2聚合為一組，NtCPI3和NtCPI4聚合為另外一組。

圖4 不同植物CPI基因氨基酸序列同源性比較Fig. 4 Alignment of deduced amino acid sequences of CPI genes of different plants

圖5 煙草與其他物種CPI同源蛋白的系統(tǒng)進化分析Fig. 5 Phylogenetic analysis of amino acid sequences of CPIs from tobacco and other species

2.2 NtCPI1、NtCPI2、NtCPI3和NtCPI4 DNA序列分析

將克隆到的NtCPI1、NtCPI2、NtCPI3和NtCPI4對應的基因組序列（圖1-E，1-J，1-O，1-T）與基因cDNA序列進行比對，結(jié)果表明，NtCPI1和NtCPI2全長分別為2835 bp和1873 bp，均由2個外顯子和1個內(nèi)含子組成。NtCPI1的2個外顯子長度依次為138 bp和426 bp，內(nèi)含子長度為2271 bp，位于第34Q和35N 2個氨基酸之間。NtCPI2的2個外顯子長度依次為187 bp和407 bp，內(nèi)含子長度為1280 bp，位于第34Q和35N 2個氨基酸之間。所有內(nèi)含子的左右邊界均為GT-AG結(jié)構(gòu)，保證在RNA加工過程中內(nèi)含子被正確識別和切除。而NtCPI3和NtCPI4不含內(nèi)含子（圖6）。

2.3 NtCPI1、NtCPI2、NtCPI3和NtCPI4 在不同組織中表達特性

以煙草根中NtCPI2的表達量為參照，測定NtCPI1、NtCPI2、NtCPI3和NtCPI4基因在煙草根、莖、葉和芽中的表達量（圖7）。由圖7可知在煙草不同組織間NtCPI1、NtCPI2、NtCPI3和NtCPI4的表達量無顯著差異（P＞0.05）；NtCPI1和NtCPI4在各組織中的表達量略高于NtCPI2、NtCPI3，但差異均不顯著（P＞0.05）。

圖6 CPI基因結(jié)構(gòu)比較Fig. 6 Comparison of the genomic organization of CPI genes

圖7 NtCPI1～4基因的組織特異性表達特征Fig. 7 Expression characteristics of NtPGIP1-4 in different tissues of tobacco

3 結(jié)論與討論

近年來，半胱氨酸蛋白酶抑制劑的研究越來越引起人們廣泛關(guān)注，先后在各種植物中克隆出多種CPI基因。本研究通過對GenBank數(shù)據(jù)庫信息的挖掘，分離到煙草CPI基因家族4個成員NtCPI1、NtCPI2、NtCPI3和NtCPI4。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)這些基因編碼的多肽均包含植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑產(chǎn)生抑制活性所必須的活性位點：靠近N端的G、QXVXG區(qū)域和靠近C端的A/PW基序。并且存在典型的植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因家族高度保守的特征模式 [LVI]-[AGT]-[RKE]-[FY]-[AS]-[VI]-x-[EDQV]-[HYFQ]-N。此外，NtCPI3和NtCPI4基因編碼的多肽N端包含有一段信號肽，說明這2個基因很可能在細胞外行使其調(diào)節(jié)功能，實現(xiàn)其抑制活性，這一特征也同許多CPI家族基因相一致。上述序列分析結(jié)果也說明NtCPI1、NtCPI2、NtCPI3和NtCPI4應屬于CPI家族。

Adeliana等[25]根據(jù)植物CPI結(jié)構(gòu)域的數(shù)量將植物CPI分為兩類：一類是單結(jié)構(gòu)域的植物CPI，大多數(shù)植物CPI屬于此類型；第二類是多結(jié)構(gòu)域的植物CPI，如具有8個結(jié)構(gòu)域馬鈴薯塊CPI和各具有3個結(jié)構(gòu)域的番茄葉部和向日葵種子的CPI[26-27]。根據(jù)這個分類依據(jù)，4個煙草CPI應該屬于單結(jié)構(gòu)域的植物CPI。Margis等[28]對32種植物CPI進行了系統(tǒng)的分析將這些植物CPI分為三類。認為所有的第一類植物CPI都含有一個與第一段植物CPI保守序列對應的核苷酸序列相隔12 bp的內(nèi)含子，但是即便內(nèi)含子具有相同的位置，每一種亞類此內(nèi)含子的大小都有很大的不同。第一亞類的蛋白還含有第二個內(nèi)含子位于mRNA 3’端非編碼區(qū)域。第三亞類蛋白含有另外的兩個內(nèi)含子，一個位于蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域與未知功能結(jié)構(gòu)域的連接區(qū)所對應的核苷酸區(qū)段，另一個位于碳末端區(qū)域。第一類和第三類植物CPI的主要不同在于第三類蛋白缺少內(nèi)含子。按照基因結(jié)構(gòu)劃分，很明顯NtCPI1和NtCPI2屬于第一類植物CPI中的第二亞類，即僅在第一段植物CPI保守序列對應的核苷酸序列之后存在一個內(nèi)含子；而NtCPI3和NtCPI4不具有內(nèi)含子，屬于第三類植物CPI。

總之，植物CPI的種類較多，在植物體內(nèi)以基因家族的形式存在，不同植物的CPI具有相同的保守區(qū)段，可能使其保持某種相似功能。植物CPI除了具有特定的保守序列外，不同植物CPI基因的一級結(jié)構(gòu)是不同的，呈現(xiàn)出多樣性和復雜性的特點，可能是植物對多樣化的生物非生物脅迫的一種適應。因此，針對植物CPI不同家族成員表達的時空模式、對環(huán)境的應答反應以及表達產(chǎn)物的底物專一性還有待進一步研究。

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Cloning and tissue expression of cysteine proteinase inhibitor (CPI)gene family inNicotiana tabacumL.

LIN Shifeng1, YUAN Ye2, REN Xueliang1, ZOU Jie1, LI Ruiyuan1, GUO Yushuang1, ZHAO Jiehong1WANG Rengang1
1 Molecular Genetics Key Laboratory of China Tobacco, Guizhou Academy of Tobacco Science, Guiyang 550081,Guizhou,China;2 Heilongjiang Tobacco Research Institute, Mudanjiang 157011, Heilongjiang,China

Full-length cDNAs of fourCPIgenes includingNtCPI1、NtCPI2、NtCPI3andNtCPI4were cloned fromNicotiana tabacumL. cv. K326 using RT-PCR and SMART RACE technique. Their sequences were deposited in GenBank with accession number KF057988,KF057989, KF057990 and KF057991. Sequence analysis showed that these four genes were predicted products of 98, 98, 120 and 123 amino acid residues, respectively. In addition to the typical inhibitory motifs, i.e. central signature motif QXVXG, a GG doublet in terminal region, and A/PW residues in C-terminal part. These deduced amino acid sequences contained PhyCys-specific LARFAV-like motif in the N-terminal region, of which a N-terminal signal peptide of 27 residues was found in both NtCPI3 and NtCPI4. Meanwhile, transcripts of these four genes were found in roots, stems, leaves and buds by real-time quantitative PCR, which indicated that they were broadly expressed in tobacco. This study laid foundation for further exploring physiological functions of these cysteine proteinase inhibitor genes in plants.

Nicotiana tabacum; cysteine proteinase inhibitor (CPI); gene family; cloning; tissue expression

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.04.016

Q81 文獻標志碼：A 文章編號：1004-5708（2014）04-0079-09

貴州省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目（黔科合NY字[2011]3047號）；中國煙草總公司重點項目（中煙辦[2010]221號）；貴州省優(yōu)秀青年科技人才培養(yǎng)對象專項資金（黔科合人字[2013]02 號）；貴州省科學技術(shù)基金項目（黔科合J字[2012]2256號）

林世鋒（1978—），博士，副研究員，研究方向為煙草遺傳育種與分子生物學，Email：linshifeng1978@163.com

通訊簡介：王仁剛（1976—），碩士，副研究員，研究方向為煙草遺傳育種與分子生物學，Email：rengangwang@126.com

2013-07-08