血清對U937細胞分化成熟及細胞周期的影響

曹林林，杜珍武，楊麒巍，侯治富＊

（1.淄博市中心醫(yī)院 檢驗科，山東 淄博255036；2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 中心研究室，吉林 長春130033）

腫瘤細胞的分化程度是癌癥診斷和治療中一個重要的參考的數(shù)據(jù)，在研究腫瘤細胞分化過程中，發(fā)現(xiàn)細胞分化與細胞停滯聯(lián)系密切[1，2]，每一次細胞分化都伴有細胞周期停滯[3]。

本研究利用乙酸肉豆蔻佛波醇（PMA）[4]體外誘導單核白血病細胞系——U937細胞分化為研究對象，通過對在有無血清培養(yǎng)條件下細胞形態(tài)及周期的變化，探討調(diào)控細胞分化成熟的機制，并為白血病的研究性治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

U937細胞株來自吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院中心研究室，胎牛血清（FCS），IMDM培養(yǎng)基，青鏈霉素均購于Hyclone公司，細胞周期檢測試劑盒購于碧云天生物技術公司，PMA購于美國Sigma公司。

1.2 U937細胞培養(yǎng)

將U937細胞株復蘇后接種于含15%胎牛血清和100ml／L青鏈霉素的IMDM培養(yǎng)基中。置于含有5%CO2，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。

1.3 血清為培養(yǎng)調(diào)節(jié)因素情況下PMA誘導U937細胞分化

根據(jù)在U937細胞培養(yǎng)過程中是否添加血清與PMA，將細胞分成4組：①FCS組：U937細胞置于含有10%FCS的IMDM培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)；②FCS＋PMA組：U937細胞置于含有10%FCS與10ng／ml PMA的IMDM培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)；③NOFCS組：U937細胞置于無FCS的IMDM培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)；④NOFCS＋PMA組：U937細胞置于無FCS但含有10 ng／ml PMA的IMDM培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后應用倒置顯微鏡進行形態(tài)學觀察、貼壁率計算與細胞周期檢測。

1.4 血清恢復實驗

分別取NOFCS和NOFCS＋PMA組培養(yǎng)24 h U937細胞，以1×106／瓶將其接種于含血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)進行培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后應用倒置顯微鏡進行形態(tài)學觀察、貼壁率計算以及細胞周期檢測。

1.5 分化后細胞的無血清培養(yǎng)

將FCS＋PMA組細胞培養(yǎng)24h后，分別置于含有血清培養(yǎng)基與無血清培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)24h后應用倒置顯微鏡進行形態(tài)學觀察、貼壁率計算與細胞周期檢測。

1.6 細胞貼壁率測定

分別收集各組懸浮細胞與貼壁細胞，應用細胞計數(shù)儀（TC10，Bio－Rad）進行細胞計數(shù)，按照下面公式進行貼壁率計算：細胞貼壁率%＝貼壁細胞數(shù)／（懸浮細胞數(shù)＋貼壁細胞數(shù)）。

1.7 流式細胞術檢測細胞周期

取各組細胞，用PBS洗滌1次。經(jīng)75%的冷酒精固定18h，1 000r／min離心5min，去除酒精，用PBS滌洗3次，加入PBS 0.5ml。用350目紗網(wǎng)過濾后加入RNA酶100μl振蕩，37℃水浴30min。加入碘化丙啶（PI）400μl振蕩，4℃30min后上流式細胞儀進行細胞周期分析。

1.8 統(tǒng)計分析

采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學處理，細胞貼壁率、細胞周期數(shù)據(jù)均以Mean±SD表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 血清對U937細胞分化過程的細胞形態(tài)影響

在FCS組細胞在血清培養(yǎng)基內(nèi)為圓形、懸浮、分散生長（圖1A），F(xiàn)CS＋PMA組細胞為貼壁生長，細胞相互粘附成團，細胞顆粒度增多（圖1B）；NOFCS組細胞懸浮、分散生長（圖1C）；NOFCS＋PMA組細胞部分聚集生長，大部分細胞仍懸浮生長（圖1D），說明血清在PMA誘導的U937細胞分化過程對于細胞的形態(tài)具有一定影響。

圖1 U937細胞在不同培養(yǎng)條件下形態(tài)學變化（200×）

2.2 血清對U937細胞分化過程的細胞貼壁率影響

FCS＋PMA組細胞貼壁率明顯高于其他3組，而NOFCS＋PMA組細胞的貼壁率與FCS組，NOFCS組無明顯差異，說明血清在PMA誘導的U937細胞分化過程對于細胞的貼壁具有一定影響。結果見表1。

2.3 血清對U937細胞分化過程的細胞周期影響

與FCS組（圖2A）相比，F(xiàn)CS＋PMA（圖2B）、NOFCS（圖2C）和NOFCS＋PMA組（圖2D）細胞周期的G1細胞明顯增多，而S期細胞明顯減少，相比有顯著差異，說明血清可以影響U937細胞的細胞周期改變，結果見圖2，表2。

表1 各組細胞的貼壁率

圖2 各組細胞的細胞周期直方圖

表2 各組細胞的細胞周期分布

2.4 血清恢復后細胞形態(tài)學觀察與細胞周期結果

NOFCS組與NOFCS＋PMA組細胞置于含有15%血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后，NOFCS組細胞懸浮生長（圖3A），細胞周期結果分析顯示與血清恢復前NOFCS組相比，G1期細胞數(shù)目明顯減少，S期細胞明顯增多（圖4A，表3）；NOFCS＋PMA組細胞貼壁生長，聚集成團（圖3B），細胞周期結果分析顯示與血清恢復前NOFCS＋PMA組相比，細胞周期無明顯改變（圖4B，表3）。

圖3 血清恢復后NOFCS組與NOFCS＋PMA組細胞形態(tài)學觀察結果

圖4 血清恢復后NOFCS組與NOFCS＋PMA組細胞周期觀察結果

表3 血清作用前后U937細胞周期分布的變化

3 討論

U937細胞是一種前單核細胞株，其特點為經(jīng)一定刺激后可向單核巨噬細胞方向分化，目前，U937細胞已經(jīng)成為體外研究細胞分化機制常規(guī)使用的細胞模型之一。乙酸肉豆蔻佛波醇（Phorbol－12－myristate 13－acetata，PMA），是二脂酰甘油（DG）的類似物，可以進入細胞內(nèi)，代替DG的活性激活蛋白酶（PKC）的活性[5]，引起細胞內(nèi)一系列的生物學效應。在體外，PMA可以誘導多種腫瘤細胞系的分化[6，7]，是一種實用良好、性能穩(wěn)定的誘導分化劑。在細胞培養(yǎng)過程中，血清作為獨立的影響因素，在腫瘤細胞體外生長過程中起著重要作用，主要由于血清含有細胞增殖與生存的必需營養(yǎng)素如某些生長因子。在無血清情況下，細胞停止增殖，細胞周期停滯于G1期，而這些細胞是否分化，各研究結論是不同的[8－11]，主要是由于研究對象及所用誘導劑不同的緣故。本研究利用PMA誘導分化U937細胞，觀察并研究以血清作為調(diào)節(jié)因素情況下，U937細胞分化成熟及細胞周期的變化。

研究結果表明，在有血清培養(yǎng)條件下，經(jīng)10ng／ml PMA作用24小時后，U937細胞形態(tài)學發(fā)生巨大變化，大量細胞由懸浮變?yōu)橘N壁生長，細胞之間由分散狀態(tài)變?yōu)楸舜苏掣綘顟B(tài)，細胞形態(tài)由圓形變?yōu)槎嘟切位驒E圓形，細胞周期表現(xiàn)為G1期細胞明顯增多，S期細胞明顯減少，并出現(xiàn)細胞凋亡現(xiàn)象。通過細胞形態(tài)、貼壁率及細胞周期的改變，可見血清促進了細胞分化成熟，也說明細胞誘導分化成功。另外細胞周期測定結果顯示，未貼壁細胞凋亡率明顯高于貼壁細胞，可能是由于細胞貼壁生長后有利于細胞的存活。本實驗分別測定了在正常血清（FCS）、血清加PMA（FCS＋PMA）、無血清（NOFCS）、無血清＋PMA（NOFCS＋PMA）4種情況下細胞周期的變化，F(xiàn)CS組與NOFCS組相比細胞周期停滯于G1期。血清恢復實驗結果表明，NOFCS＋PMA組細胞周期仍停滯于G1期，而NOFCS組細胞周期開始恢復。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的可能原因有兩個：一是PMA作用，因為在整個實驗過程中PMA在細胞體內(nèi)不易代謝，可長期發(fā)揮作用。所以在血清恢復后可繼續(xù)發(fā)揮作用；二是據(jù)文獻報道在無血清情況下，細胞CyclinD表達會下降，但在血清恢復后，可能重新恢復表達，促進細胞周期的進程[12]。

細胞周期的進程主要由兩組相互消長的蛋白控制即細胞周期蛋白及細胞周期依賴性激酶、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白[13]。對于細胞周期G1期的停滯可以通過下調(diào)細胞周期蛋白酶的活性或上調(diào)細胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白活性來進行調(diào)控。本研究同時證實了PMA對U937細胞的分化發(fā)揮重要調(diào)控作用，有利于尋找新型抗白血病藥物，但具體的調(diào)控機制還在進一步探討之中。

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