HAIN用于檢測(cè)原發(fā)性耐藥結(jié)核的研究

劉亞芹，楊振斌，馮冬霞

（聊城市傳染病醫(yī)院 檢驗(yàn)科，山東 聊城252000）

HAIN是由德國(guó)Hain Lifescience公司推出的一種檢測(cè)結(jié)核菌對(duì)異煙肼和利福平是否耐藥的技術(shù)，該技術(shù)基于多重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過反向雜交技術(shù)與預(yù)先固化在試紙條上的特異性探針雜交，通過雜交條帶的顯色情況來(lái)判定結(jié)核菌對(duì)利福平和異煙肼的耐藥性。HAIN技術(shù)6h出結(jié)果，比常規(guī)比例法藥敏（60天）快的多。原發(fā)耐藥結(jié)核病是指沒有接受過抗結(jié)核藥物治療而發(fā)生耐藥的菌株感染引起的疾病，對(duì)該病的耐藥檢測(cè)常規(guī)采用比例法，我國(guó)每年新發(fā)結(jié)核病人近百萬(wàn)，如此嚴(yán)重的疫情，急需新的檢測(cè)方法，我們通過收集新發(fā)涂陽(yáng)結(jié)核病人的痰標(biāo)本，對(duì)標(biāo)本分別進(jìn)行培養(yǎng)、比例法藥敏和HAIN（線性探針）檢測(cè)，來(lái)分析HAIN在原發(fā)耐藥結(jié)核檢測(cè)中的可行性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源 隨機(jī)抽取我市2012年7月至2013年3月新發(fā)痰涂片陽(yáng)性的病人338例，選其痰標(biāo)本2個(gè)。一個(gè)用HAIN檢測(cè)，一個(gè)進(jìn)行培養(yǎng)和比例法藥敏。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株 H37RV即結(jié)核分枝桿菌（ATC C27294），由山東省胸科醫(yī)院漢光國(guó)際感染疾病研究中心贈(zèng)與。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 ①HAIN方法：生物安全柜、博日Life Touch基因擴(kuò)增儀、Twincubator雜交儀、水浴鍋、超聲破碎儀、離心機(jī)、雜交儀，水浴鍋，移液器（1000μl，200μl，10μl）3套。②培養(yǎng)和比例法藥敏設(shè)備：培養(yǎng)基蒸汽凝固滅菌器，ZHN－4型，中國(guó)原子能科學(xué)研究院；電子天平，F(xiàn)A1604型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器公司，精度達(dá)1／10000級(jí)。

1.2.2 試劑 ①HAIN方法，試劑：消化前處理液（4%NaOH，2.94%檸檬酸鈉，NALC），無(wú)菌 PBS，無(wú)菌蒸餾水，PNM，熱啟動(dòng)Taq酶試劑盒，分子生物級(jí)水，Genotype試劑盒，蒸餾水。②比例法，標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁埽菇Y(jié)核藥物純品：異煙肼（INH）、利福平（RIF）、氧氟沙星（OFL）、卡那霉素（KM）純粉，對(duì)硝基苯甲酸（PNB）培養(yǎng)基、噻吩－2－羧酸（TCH）培養(yǎng)基、L－J羅氏培養(yǎng)基。

1.3 方法

1.3.1 比例法 按照結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程[1]進(jìn)行如下操作。a.培養(yǎng)基制備：①基礎(chǔ)培養(yǎng)基：中性羅氏培養(yǎng)基。②含藥培養(yǎng)基：INH、RIF溶解、稀釋于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分裝7ml／管，斜置于蒸汽凝固滅菌器內(nèi)，85℃凝固50min。制成的培養(yǎng)基37℃無(wú)菌試驗(yàn)24h，檢查無(wú)污染，4℃避光保存，1個(gè)月內(nèi)使用。b.培養(yǎng)。c.藥物敏感性試驗(yàn)：制備菌懸液，刮取菌齡2－3周的結(jié)核分枝桿菌菌落（刮取斜面各個(gè)部分培養(yǎng)物），研磨，以0.5%吐溫－80生理鹽水稀釋，配成1mg／ml菌懸液。用22SWG標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)取2滿環(huán)1mg／ml菌液，平移至2ml滅菌生理鹽水中，即成10－2mg／ml菌液，再以同法稀釋成10－4mg／ml菌液，用22SWG標(biāo)準(zhǔn)環(huán)分別取1滿環(huán)10－2mg／ml和10－4mg／ml菌液，用劃線法均勻接種至含藥培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基斜面上，37℃培養(yǎng)4周后報(bào)告結(jié)果。若耐藥百分比大于1%，則判耐藥。耐藥百分比＝含藥培養(yǎng)基的菌落數(shù)／對(duì)照培養(yǎng)基的菌落數(shù)×100%。

1.3.2 HAIN方法 a.DNA提?。喝√禈?biāo)本轉(zhuǎn)移到50ml離心管，中和離心法進(jìn)行處理后，取1ml轉(zhuǎn)入1.5ml離心管。每管加150μl無(wú)菌水，95度水浴20min，超聲裂解15min，12 000rpm離心5 min。上清轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管。b.PCR擴(kuò)增：擴(kuò)增體系配制50μl，取5μl DNA樣本到擴(kuò)增體系中，15min 95℃1個(gè)循環(huán)，30sec95℃10個(gè)循環(huán)，2min 58℃、25sec 95℃、40sec、53℃、40sec 70℃30個(gè)循環(huán)，8min 70℃1個(gè)循環(huán)。c.雜交20μl變性液（DEN），20μl擴(kuò)增產(chǎn)物混勻入槽，室溫5min，加1 ml 45℃預(yù)熱的 HYB（雜交緩沖液），放入DNA.strip，45℃30min，吸出 HYB，加 1ml漂洗液（STR），45℃15min，吸出STR，加入按1∶100稀釋的底物，室溫30min，吸出，洗滌3次，加底物顯色液室溫10min，加1ml水洗兩次。d.結(jié)果判讀說(shuō)明：每個(gè)探針試條27個(gè)條帶，共4個(gè)區(qū)域：1區(qū)含3個(gè)條帶為標(biāo)記物質(zhì)控、擴(kuò)增質(zhì)控、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（TUB）；2區(qū)為rpoB區(qū)含13個(gè)條帶分別是rpoB位點(diǎn)質(zhì)控、rpoB野生條帶1到8（rpoBWT1、rpoBWT2……rpoBWT8）、rpoB突變條帶4條（rpoBMUT1、rpoBMUT2A、rpoBMUT2B、rpoBMUT3）；3區(qū)為katG區(qū)含4個(gè)條帶分別是katG位點(diǎn)質(zhì)控、katG野生條帶（katGWT1）、katG突變條帶2條（katGMUT1、katGMUT2）；4區(qū)為inhA 區(qū)含8個(gè)條帶分別是inhA位點(diǎn)質(zhì)控、inhA野生條帶2條（inhAWT1、inhAWT2）、inhA 突變條帶5條（inhAMUT1、inhAMUT1、inhAMUT2、inhAMUT3A、inhA3B）。耐藥：WT條帶缺失或MUT條帶出現(xiàn)；敏感：所有 WT條帶都出現(xiàn)且所有MUT條帶缺失；結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群：TUB條帶出現(xiàn)；未檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌：TUB條帶缺失。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對(duì)兩種方法在結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測(cè)中的比較采用配對(duì)四格表資料的χ2檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 比例法結(jié)果

338例新發(fā)涂陽(yáng)病人中，共培養(yǎng)出336株菌株，其中2株為污染，336例菌株經(jīng)PNB、TCH初步鑒定，323株為結(jié)核分枝桿菌，13株為非結(jié)核分枝桿菌，對(duì)這13例病人HAIN方法的檢測(cè)結(jié)果均為：未檢出結(jié)核分枝桿菌（TUB條帶缺失）。這323例結(jié)核病人的菌株被納入比較分析，其比例法的藥敏結(jié)果是257株對(duì)INH、RIF兩種藥物全部敏感，18株只對(duì)INH耐藥，10株只對(duì)RIF耐藥，耐多藥（同時(shí)耐INH和RIF）的38株。

2.2 HAIN的結(jié)果、并與比例法比較

HAIN的結(jié)果是，56株比例法檢出為INH耐藥株（含38株同時(shí)耐INH和RFP的菌株）中，45株HAIN檢測(cè)為耐藥，其中katG（WT缺失，MUT1出現(xiàn)）35例，該情況在異煙肼耐藥中出現(xiàn)最多，占到了77.8%，其他包括katG（WT缺失，MUT2出現(xiàn)）4例，InhA （WT1缺失，MUT1出現(xiàn)）3例，InhA（WT2缺失，MUT3A出現(xiàn)）3例。48株比例法檢出為RIF耐藥株（含38株同時(shí)耐INH和RFP的菌株）中，46株檢出為RIF耐藥，其中rpoB（WT8缺失，MUT3出現(xiàn)）22例，該情況在利福平耐藥中出現(xiàn)最多，占到了47.8%，其他包括rpoB（WT7缺失，MUT2A出現(xiàn)）8例，rpoB（WT3或和 WT4缺失，MUT1出現(xiàn)）5例，rpoB（WT7缺失，MUT2B出現(xiàn)）3例，rpoB（WT7缺失，MUT全缺失）3例等。

HAIN與比例法對(duì)異煙肼耐藥性檢測(cè)的結(jié)果比較如下表1所示，χ2＝0.05，P＝0.823，兩種方法在檢測(cè)結(jié)核菌對(duì)異煙肼耐藥中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其靈敏性和特異性分別為80.4%和96.6%。

表1 HAIN與比例法對(duì)異煙肼耐藥性的檢測(cè)結(jié)果比較（以比例法為金標(biāo)準(zhǔn)）

對(duì)利福平耐藥性檢測(cè)結(jié)果的比較如下表2所示，χ2＝0，P＝1.000，兩種方法在檢測(cè)結(jié)核菌對(duì)利福平耐藥中差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其靈敏性和特異性分別為95.8%和99.6%。

表2 HAIN與比例法對(duì)利福平耐藥性的檢測(cè)結(jié)果比較（以比例法為金標(biāo)準(zhǔn)）

HAIN與比例法對(duì)耐多藥結(jié)核檢測(cè)結(jié)果的比較如下表3所示，χ2＝0.07，P＝0.790，兩種方法在對(duì)耐多藥結(jié)核的檢測(cè)中差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其靈敏性和特異性分別為78.9%和97.9%。

表3 HAIN對(duì)耐多藥結(jié)核的檢測(cè)結(jié)果與比例法比較（以比例法為金標(biāo)準(zhǔn)）

3 討論

HAIN技術(shù)，通過檢測(cè)RIF耐藥相關(guān)基因rpoB、INH的耐藥基因KatG、inhA基因啟動(dòng)子的野生型及突變型，來(lái)判斷是否耐藥。在利福平耐藥菌株中95%以上是由于rpoB基因突變所致[2]HAIN法對(duì)RIF的檢測(cè)結(jié)果與比例法的藥敏復(fù)合較好，說(shuō)明ropB、katG、inhA基因作為結(jié)核分枝桿菌耐藥性快速診斷標(biāo)志具有很好的代表性，并且rpoB的位點(diǎn)突變中，531（對(duì)應(yīng) HAIN中rpoB的MUT3）、526（對(duì)應(yīng) HAIN 中rpoB的 MUT2A、MUT2B）位的突變最為常見[3]，除上述兩位點(diǎn)外，516（對(duì)應(yīng)HAIN中rpoB的MUT1）等也是引起耐藥的原因。在對(duì)INH的檢測(cè)中，有20%的耐藥菌株 HAIN未檢出，原因有可能是，除KatG、inhA外，KaSA和ahpc基因也與異煙肼的耐藥有一定的關(guān)系，ahpc基因突變可導(dǎo)致ahpc表達(dá)增強(qiáng)，它的過量表達(dá)可以補(bǔ)償因KatG基因突變的損失，一般將ahpc基因作為KatG基因損傷的標(biāo)志[4]，另外，除突變引起耐藥外，分枝桿菌存在藥物主動(dòng)外排泵的表達(dá)，并被視為是可能的另一種重要耐藥機(jī)制[5，6]。

HAIN技術(shù)也有一定的局限性，操作過程中提取結(jié)核菌DNA時(shí)，因結(jié)核菌的細(xì)胞壁堅(jiān)韌，裂解困難，提取效率不是太高，如果痰標(biāo)本中結(jié)核菌數(shù)目少，或存在抑制DNA的物質(zhì)，都可能造成假陰性[7]，另外HAIN中的PCR試驗(yàn)很容易造成實(shí)驗(yàn)室污染，可能導(dǎo)致假陽(yáng)性。

38例耐多藥結(jié)核患者中，比例法顯示廣泛耐藥（XDR）的5例。本文應(yīng)用HAIN技術(shù)中的 MTBDRplus，在檢測(cè)了結(jié)核菌對(duì)異煙肼、利福平的耐藥性后，又通過HAIN的另一項(xiàng)MTBDRs／檢測(cè)了38例耐多藥結(jié)核對(duì)氟奎諾酮、乙胺丁醇、氨基糖苷類／環(huán)肽類抗生素的耐藥性，結(jié)果與比例法的藥敏也有很高的一致性。

我國(guó)是27個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，不合理用藥、治療管理不善、藥物供應(yīng)不足與質(zhì)量不佳以及間斷用藥等導(dǎo)致耐多藥病例的發(fā)生，這些病例在未被發(fā)現(xiàn)或未得到有效治療時(shí)，作為傳染源，可使新被感染而發(fā)病的人，從一開始就是原發(fā)耐藥結(jié)核病患者。因此盡快發(fā)現(xiàn)和治療耐藥結(jié)核病人非常重要，只有減少了耐藥結(jié)核的病人，減少其在正常人群中傳播，才能有效減少原發(fā)耐藥結(jié)核病的發(fā)生，而HAIN的快速特點(diǎn)恰恰適合這一需求。我們通過HAIN技術(shù)對(duì)結(jié)核的原發(fā)耐藥性進(jìn)行研究，了解了新發(fā)結(jié)核病人的耐藥特性，為臨床診斷、選擇和調(diào)整原發(fā)耐藥結(jié)核病的治療方案及時(shí)提供參考依據(jù)，在積極應(yīng)對(duì)結(jié)核尤其是原發(fā)耐藥結(jié)核方面，HAIN與比例法相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，又因其快速，所以HAIN具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

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