利用大鼠制備去竇弓神經(jīng)的方法及其效應(yīng)的研究

姜 憲，蘭 艷，楊艷召，李麗威，盧煥俊，李香蘭，金元哲＊

（1.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉科；2.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)教研部，長(zhǎng)白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（延邊大學(xué)），吉林 延吉133002）

眾所周知壓力感受性反射是哺乳動(dòng)物調(diào)節(jié)血壓最重要的神經(jīng)調(diào)節(jié)機(jī)制。頸動(dòng)脈竇和主動(dòng)脈弓上的感受器將傳入沖動(dòng)分別經(jīng)竇神經(jīng)和主動(dòng)脈神經(jīng)投射到孤束核，并與延髓和腦干的各種心血管活動(dòng)有關(guān)的神經(jīng)元發(fā)生聯(lián)系，快速的調(diào)節(jié)交感和副交感神經(jīng)的張力，保證機(jī)體血壓相對(duì)穩(wěn)定。Krieger等[1]于1964年最初在研究神經(jīng)源性高血壓模型時(shí)，曾用過切斷壓力感受性反射傳入神經(jīng)的方法。但是到了1981年有人[6]利用清醒動(dòng)物24h連續(xù)監(jiān)測(cè)血壓后發(fā)現(xiàn)，這種動(dòng)物平均血壓水平并未升高，只是血壓不穩(wěn)定性加大。近期許多學(xué)者提出，壓力感受性反射敏感性是鑒定血壓影響心率的重要指標(biāo)，可以反映機(jī)體調(diào)節(jié)體循環(huán)血壓的功能狀態(tài)[8]。劉偉也曾報(bào)到，5種去竇弓神經(jīng)對(duì)清醒大鼠壓力感受性反射敏感性的影響[9]。但是，大鼠的竇弓神經(jīng)走行變異比較大，尤其是主動(dòng)脈神經(jīng)在大鼠單獨(dú)走行率較低，術(shù)后動(dòng)物生存率也不高。關(guān)于怎樣去除小動(dòng)物竇弓神經(jīng)，尚無詳細(xì)的介紹。本文較為詳細(xì)地介紹了清醒狀態(tài)下，利用大鼠制備破壞竇弓神經(jīng)的方法，并觀察了這種處理對(duì)壓力感受性反射敏感性的影響，為利用小動(dòng)物研究竇弓反射在心血管功能調(diào)節(jié)機(jī)制提供可靠的實(shí)驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

實(shí)驗(yàn)選用體重在250±30g的SD系雄性清潔級(jí)大鼠共24只（購自吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。許可證號(hào)碼：SCXK（吉）－2011－0004）。動(dòng)物隨機(jī)分成正常組（Normal group）、假手術(shù)組（Sham group，SHAM）、壓力感受器破壞組（Sinoaortic denervation，SAD），每組8只。為了避免麻醉對(duì)動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)和心理行為學(xué)的影響，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在清醒狀態(tài)下觀察各項(xiàng)指標(biāo)。動(dòng)物飼養(yǎng)室溫度維持在18－26℃，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)3天。本研究嚴(yán)格依照國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例及實(shí)施細(xì)則進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.2 破壞竇弓反射動(dòng)物模型制備

用10%水合氯醛（300mg／kg）腹腔注射麻醉，動(dòng)物仰臥位固定。頸部備皮，碘伏消毒、酒精脫碘后，在頸前部“U”形切開皮膚。分離頜下腺，縫合固定于兩側(cè)口角，牽拉下頜角，分離頸動(dòng)脈三角區(qū)肌肉及筋膜。解剖顯微鏡下小心暴漏頸內(nèi)外動(dòng)脈分叉處，即可見從頭側(cè)向內(nèi)斜上行匯入到舌下神經(jīng)的1－3條纖細(xì)的竇神經(jīng)，分離切斷，并用四氯化碳棉球纏繞頸動(dòng)脈竇約2min腐蝕損傷可能殘存的竇神經(jīng)分支（為防止損傷在周邊上行的其他神經(jīng)，周圍用干棉球保護(hù)）。SD大鼠主動(dòng)脈神經(jīng)自主動(dòng)脈弓處發(fā)出后，位于頸主動(dòng)脈鞘后方，迷走神經(jīng)內(nèi)側(cè)，非常纖細(xì)。切斷肩胛舌骨肌，鈍性剝離鞘前靜脈，切開頸動(dòng)脈鞘后，向內(nèi)側(cè)牽拉頸主動(dòng)脈，在匯入喉上神經(jīng)處切斷主動(dòng)脈神經(jīng)，然后逐層縫合。

1.3 血壓與心率測(cè)定

腹腔注射10%水合氯醛（300mg／kg）麻醉，顯微鏡下在腹股溝區(qū)分離股動(dòng)靜脈，經(jīng)股動(dòng)脈插入灌有肝素鈉溶液的導(dǎo)管至腹主動(dòng)脈，經(jīng)股靜脈插入灌有生理鹽水的聚乙烯管至下腔靜脈。用穿皮針分離皮下組織后，經(jīng)腹股溝、后背穿至頭頂，剪出一個(gè)小口，把動(dòng)靜脈導(dǎo)管的一端拉出，纏繞膠布固定。測(cè)定開始前解開動(dòng)靜脈導(dǎo)管，動(dòng)脈與RM－6240生物記錄系統(tǒng)（成都儀器廠）連接，測(cè)平均血壓（mean arterial pressure，MAP）及心率（hart rate，HR）。靜脈插管用于注射苯腎上腺素（15μg／kg 3min）或硝普鈉（15 μg／kg 3min）誘發(fā)壓力感受性反射。

1.4 數(shù)據(jù)處理

參照Smyth[5]方法，采用靜脈注射苯腎上腺素或硝普納誘發(fā)壓力感受性反射后，測(cè)定用藥前后的心率與平均動(dòng)脈壓的變化值之比（ΔHR／ΔMAP＝HRafter－HRbefor／MAPafter－MAPbefor，bpm／mmHg）作為壓力感受性反射敏感性指標(biāo)。

所有數(shù)據(jù)均用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理，并用Mean±SD表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用單因素方差分析，以P＜0.05定為有顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 竇弓神經(jīng)走行特點(diǎn)及去竇弓神經(jīng)后動(dòng)物的一般狀態(tài)

本實(shí)驗(yàn)用24只SD系大鼠觀察了竇神經(jīng)和主動(dòng)脈神經(jīng)的走行特點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)該系大鼠竇神經(jīng)，在頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處起點(diǎn)膨大部分向內(nèi)斜上行匯入到舌下神經(jīng)，其走行比較單一，容易區(qū)分。但是主動(dòng)脈神經(jīng)的走行有較大的變異，在所觀察的24只動(dòng)物中有17只動(dòng)物在頸部單獨(dú)走行，約占70%。切開頸動(dòng)脈鞘后把迷走神經(jīng)輕輕向外牽拉，就會(huì)看到非常細(xì)的主動(dòng)脈神經(jīng)，在迷走神經(jīng)和頸交感神經(jīng)之間并行，并匯入喉上神經(jīng)、迷走神經(jīng)后投向中樞（圖1）。其余動(dòng)物均無法單獨(dú)辨別主動(dòng)脈神經(jīng)。

動(dòng)物在水合氯醛麻醉下，切除主動(dòng)脈神經(jīng)和竇神經(jīng)后，大約過1.5h即可從麻醉中醒來。待術(shù)后24h時(shí)動(dòng)物精神萎靡、反應(yīng)遲鈍，而且受刺激時(shí)易怒及煩躁。去竇弓神經(jīng)后動(dòng)物的死亡率較高，在實(shí)驗(yàn)的早期死亡率約為50%。但是在后期的實(shí)驗(yàn)中，利用單獨(dú)飼養(yǎng)，嚴(yán)格控制室溫在25℃上下2℃左右、濕度60%，避免各種噪聲刺激后，動(dòng)物的生存率提高到75%左右。

2.2 苯腎上腺素和硝普鈉對(duì)正常動(dòng)物血壓和心率的影響

圖1 大鼠左側(cè)頸部血管和神經(jīng)走行模式圖

正常動(dòng)物股靜脈注射生理鹽水對(duì)血壓和心率無明顯影響，但是苯腎上腺素（PE，15μg／kg 3min）和硝普鈉（SNP，15μg／kg 3min）卻使血壓和心率的變化非常明顯。由圖2可見，PE使血壓急劇升高，約在1min時(shí)達(dá)到高峰，平均由對(duì)照值的97.6±6.10mmHg 升高到 127.34±7.34mmHg（P＜0.01），4min時(shí)基本恢復(fù)到正常狀態(tài)。與此同時(shí)，心率顯著下降，平均由409.22±5.69beat／min下降到327.67±10.45beat／min（P＜0.01）。靜脈注射SNP后，血壓明顯下降，而心率則顯著加快，分別由基礎(chǔ)狀態(tài)的105.30±3.75mmHg和415.72±3.34beat／min，變成70.87±3.50mmHg和459.83±5.83beat／min，組間比較P值均小于0.01（圖2，3。表1）。

圖2 靜脈注射PE和SNP對(duì)正常動(dòng)物動(dòng)脈平均血壓的影響

圖3 正常動(dòng)物靜脈注射苯腎上腺素和硝普鈉對(duì)心率的影響

另外，還對(duì)比觀察了PE和SNP對(duì)壓力感受性反射敏感性的影響。發(fā)現(xiàn)正常動(dòng)物使用PE時(shí)伴隨著短時(shí)間內(nèi)血壓迅速增高，心率快速下降；而使用SNP時(shí)隨著血壓的下降，心率相應(yīng)加快，壓力感受性反射敏感性始終處于相對(duì)穩(wěn)定水平。

2.3 去竇弓神經(jīng)對(duì)壓力感受性反射敏感性的影響

去竇弓神經(jīng)后PE和SNP同樣能夠?qū)е聞?dòng)物的血壓和心率的顯著變化。注射PE后血壓由對(duì)照值的94.77±2.79mmHg升高到130.71±4.87 mmHg（P＜0.01），而SNP則使血壓由對(duì)照值的104.04±2.26mmHg下降到69.05±3.81mmHg（P＜0.01），而且各組間其變化幅度相差無異，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表1）。與血壓的變化不同，注射PE和SNP后使去竇弓神經(jīng)動(dòng)物的心率變化明顯減小甚至發(fā)生相反的變化。靜脈注射PE心率不下降，反而加快，由對(duì)照值的420.86±7.59加快到506.50±9.45beat／min，與其他兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。靜脈注射SNP后心率雖加快，但幅度明顯降低，由對(duì)照值的422.17±7.50加快到428.00±7.95（P＜0.05），與正常組和假手術(shù)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

表1 不同組使用藥物時(shí)血壓的變化（mmHg）

表2 不同組使用藥物時(shí)心率的變化（beat／min）

2.4 去竇弓神經(jīng)對(duì)壓力感受性反射敏感性的影響

靜脈注射PE時(shí)壓力感受性反射的敏感性在正常組和假手術(shù)組均表現(xiàn)為負(fù)值（分別是－2.77±0.76和－2.74±0.43）。但是同時(shí)摘除竇神經(jīng)和主動(dòng)脈神經(jīng)后，卻反轉(zhuǎn)成正值（2.48±0.59）。靜脈注射硝普鈉后壓力感受性反射敏感性由正常組和假手術(shù)組的－1.2±0.14及－1.2±0.13，下降到－0.18±0.03。以上可以看出SD大鼠壓力感受器傳入神經(jīng)切斷后，壓力感受器敏感性明顯減弱，與正常組及假手術(shù)組比較，有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＜0.05（見表4、5）。提示SD大鼠的竇神經(jīng)和主動(dòng)脈神經(jīng)破壞成功，可作為壓力感受器破壞模型。

圖4 股靜脈注射PE對(duì)壓力感受性反射敏感性的影響

3 討論

圖5 靜脈注射SNP對(duì)壓力感受性反射敏感性的影響

壓力感受性反射在心排出量、外周阻力、血量等發(fā)生突然變化的情況下，對(duì)動(dòng)脈血壓進(jìn)行快速調(diào)節(jié)的過程中起著重要的作用，使動(dòng)脈血壓不至發(fā)生過分的波動(dòng)。壓力感受性反射的感受器位于雙側(cè)頸動(dòng)脈竇和主動(dòng)脈弓，其傳入神經(jīng)分別經(jīng)竇神經(jīng)和主動(dòng)脈神經(jīng)傳入到延髓的孤束核。孤束核位于延髓背側(cè)、包繞于孤束周圍的“Y”形柱狀核團(tuán)，是延髓唯一接受血壓、心率和循環(huán)血量改變的傳入信號(hào)的感覺核[2]。已有研究表明在一定范圍內(nèi)，壓力感受器傳入沖動(dòng)頻率與動(dòng)脈管壁被動(dòng)擴(kuò)張程度成正比，在同一血壓水平對(duì)脈動(dòng)性壓力刺激比持續(xù)性壓力刺激更敏感[10]，使機(jī)體在各種內(nèi)外環(huán)境的變化中維持體循環(huán)血壓的相對(duì)穩(wěn)定。

本實(shí)驗(yàn)利用SD系大鼠制備了去竇弓反射模型。因?yàn)楦]神經(jīng)及主動(dòng)脈神經(jīng)很纖細(xì)，并與迷走神經(jīng)、舌下神經(jīng)、喉上神經(jīng)、喉返神經(jīng)、交感神經(jīng)干及頸部大血管密切相鄰[4]，假如術(shù)中發(fā)生損傷，術(shù)后大鼠死亡率較高，故明確及掌握大鼠頸部解剖是模型制作成功的關(guān)鍵。SD系大鼠的竇神經(jīng)位于下頜下二腹肌后腹與頸動(dòng)脈分叉所形成的頸動(dòng)脈三角內(nèi)。牽開二腹肌后腹就可看到與二腹肌相平行的舌下神經(jīng)，剝開頸動(dòng)脈鞘暴露頸動(dòng)脈交叉處，小心清理分叉處軟組織，梳理頸內(nèi)、外動(dòng)脈，就可看到來源于頸動(dòng)脈竇的從后下向前上走行加入舌下神經(jīng)的竇神經(jīng)[3]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)[11]竇神經(jīng)有1～數(shù)條，但我們操作中沒有見到1條以上的竇神經(jīng)。但為了確保去神經(jīng)完整，術(shù)中徹底清理頸動(dòng)脈竇周圍軟組織，并用纖細(xì)的石碳酸棉球包裹頸動(dòng)脈竇約2min，腐蝕及破壞神經(jīng)。主動(dòng)脈神經(jīng)來源于主動(dòng)脈弓壓力感受器，在頸部與兩側(cè)頸總動(dòng)脈相并行，加入迷走神經(jīng)在頸部的第一分支喉上神經(jīng)。牽開或切斷肩胛舌骨肌，剝開頸動(dòng)脈鞘，看到向后繞行于頸主動(dòng)脈，并與之垂直走行的喉上神經(jīng)，向內(nèi)牽開頸總動(dòng)脈，就可見到喉上神經(jīng)進(jìn)入迷走神經(jīng)之前與迷走神經(jīng)相平行并入喉上神經(jīng)的非常纖細(xì)的主動(dòng)脈神經(jīng)。

頸動(dòng)脈竇、主動(dòng)脈弓壓力感受性反射又稱為減壓反射，安靜狀態(tài)下竇神經(jīng)和主動(dòng)脈神經(jīng)不斷發(fā)出神經(jīng)沖動(dòng)，經(jīng)孤束核作用于延髓腹外側(cè)核，抑制心交感和交感縮血管中樞，使血壓穩(wěn)定在一定水平。壓力感受性反射敏感性（baroreflex sensitiviry，BRS）是反應(yīng)哺乳動(dòng)物自主神經(jīng)活動(dòng)狀態(tài)的指標(biāo)，為了明確去竇弓反射模型制備是否成功，接著參照Smyth[5]的方法，觀察了BRS。發(fā)現(xiàn)用α型腎上腺素能受體興奮劑苯腎上腺素血壓仍然明顯升高，但心率不但不出現(xiàn)減慢反而加快，BRS表現(xiàn)正值。使用硝普鈉后血壓下降時(shí)，心率輕度加快，并且BRS明顯受到抑制。證明制備去竇弓反射成功。

另外，實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，去竇弓反射的動(dòng)物死亡率較高，約在50%左右。所以在制備模型后動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，精心照料是提高生存率的關(guān)鍵。

本試驗(yàn)所提供的動(dòng)物模型，經(jīng)濟(jì)而實(shí)惠，為非竇弓反射性血壓調(diào)控機(jī)制的研究提供重要的試驗(yàn)方法。

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