藜麥葉片黃酮類物質(zhì)的提取及基因型差異

陸敏佳，蔣玉蓉，陳國林，毛 前，陸國權(quán)

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 臨安 311300；2.浙江水利水電學(xué)院 水利工程系，浙江杭州 310018)

藜麥Chenopodium quinoa又稱南美藜、藜谷、奎奴亞藜等，是1年生的藜科Chenopodiaceae草本作物，在安第斯山脈種植已有5 000多年的歷史，被印加人稱為 “谷物之母”和 “安第斯山的真金”[1－2]。藜麥蛋白質(zhì)含量高，具有近乎完美的氨基酸組成，富含不飽和脂肪酸、類黃酮、維生素E等多種有益化合物，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織認(rèn)定的唯一的完美營養(yǎng)食品，被譽(yù)為 “未來的超級谷物” “營養(yǎng)黃金”“有機(jī)谷類之王”等[3－4]。長期食用藜麥，對心臟病、高血壓、高血糖、高血脂等有很好防治作用。藜麥喜熱帶、亞熱帶干濕氣候，生長溫度為2.0～35.0℃，生長適溫14.0～18.0℃，在營養(yǎng)生長階段可耐輕度霜凍(－1.0～0℃)，在種子結(jié)實之后可耐－6.0℃低溫，對鹽堿、干旱、霜凍、病蟲害等的抗性能力都很強(qiáng)，植株在自然肥力低的情況下仍能生長良好[5]。由于藜麥的營養(yǎng)價值在提供糧食和營養(yǎng)安全等方面的突出作用，聯(lián)合國大會宣布2013為 “國際藜麥年”[6]。黃酮類化合物是一種生理活性活潑的物質(zhì)，具有降低血管脆性及異常的通透性、降血壓、降血脂及膽固醇、抗病毒、抗炎、抗癌防癌、抗氧化等藥理作用，尤以對心腦血管疾病的治療作用而備受重視[7－8]。研究者已用不同方法在銀杏Ginkgo biloba[9]，甘薯Ipomoea batatas[8]，花 生 Arachis hypogaea[10]，大 蒜 Allium sativum[11]，蕎 麥 Fagopyrum esculentum[12]，小白菜 Brassica rapa chinensis[13]，金銀花 Lonicera japonica[14]以及豆科 Leguminosae 植物[15－16]中等進(jìn)行了黃酮提取和含量測定。藜麥谷粒中比較豐富的類黃酮物質(zhì)異黃酮和維生素E組合可明顯促進(jìn)糖、脂代謝和胰島素分泌，對糖尿病的治療作用明顯[17－19]。然而，有關(guān)藜麥黃酮類化合物的研究國內(nèi)外報道甚少[20]。本研究著重討論藜麥葉片黃酮類物質(zhì)的提取和測定方法，進(jìn)而分析基因型間的差異，為藜麥葉片黃酮類物質(zhì)的開發(fā)利用和高黃酮高氧化性資源的篩選提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

藜麥盆栽40 d后，摘取新鮮葉片，于陰涼通風(fēng)處晾干后，置于80℃鼓風(fēng)烘箱中干燥12 h，取出后用粉碎機(jī)充分粉碎，過0.5 mm孔篩篩選，裝入干燥器皿中備用。

1.2 試劑及儀器

主要試劑:蘆丁對照品購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器:DHG 9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)、TP-214電子天平(丹佛儀器有限公司)、XMTD-6000恒溫水浴鍋(上海申勝生物技術(shù)有限公司)、TDL-40B臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、752PC紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)。

1.3 藜麥類黃酮的提取

以藜麥品種PI814932為材料，精確稱取其全粉1.00 g，置于圓底燒瓶中。采用水浴回流加熱法進(jìn)行提取試驗。選擇影響藜麥葉片黃酮得率的主要因素如乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、浸提時間等3個因素為考察因子，按照L9(33)正交表安排不同提取條件試驗(表1)，以確定最佳提取條件。

1.4 藜麥總黃酮量的測定

鑒于目前以蘆丁為標(biāo)樣的比色法是測定黃酮得率最常用的方法[21]，本研究仍沿用該法來測定藜麥總黃酮得率。準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)試劑5.000 mg，用體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇完全溶解后定容至50.0 mL，搖勻的質(zhì)量濃度為0.1 g°L－1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL于6只10.0 mL刻度試管中，用體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇補(bǔ)至5.0 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，放置6 min，再加入1.0 mol°L－1氫氧化鈉溶液4.0 mL，混勻，再加體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇0.4 mL，室溫放置15 min后于波長501 nm處測定其吸光度，以體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇溶液為空白對照，建立測定標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性回歸方程。測定時，以不同的樣品液代替蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，其他步驟與制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)方程相同。計算公式如下:總黃酮得率(%)= (C×V1×V2×10－3)/(W/V0)×100。其中: C 為測定樣液的質(zhì)量濃度(g°L－1)；V0為測定吸光度所用樣液的體積(mL)； V1為測定時稀釋體積(mL)； V2為樣液定容后體積(mL)； W 為樣品質(zhì)量(g)。

表1 L9(33)正交表和實驗結(jié)果Table1 Orthogonal table L9(33) and experimental results

1.5 藜麥重復(fù)性試驗及其加樣回收率試驗

精確稱取藜麥品種 ‘TEMUCO Quinoa TRADITIONAL’ 共6份相同樣品，按上述最佳提取和測定方法進(jìn)行重復(fù)性試驗，驗證可靠性。選上述藜麥品種 ‘TEMUCO Quinoa TRADITIONAL’，設(shè)定不同加入量，6次重復(fù)，加入已知量蘆丁樣液，計算回收率，黃酮提取和測定方法同上。

1.6 藜麥黃酮得率的基因型差異

選擇 ‘TEMUCO Quinoa TRADITIONAL’‘QuinoaB.Rain Sow’‘Temuco’‘1591 Quinoa Cherry’‘Tomico Quinoa’‘CQ-TEMVCC’‘PI814932’‘PI596293’‘Tumuco(7)hybrids’‘PsI596498’10 個不同基因型藜麥品種，統(tǒng)一播種和管理，采用上述同樣方法進(jìn)行制樣。然后采用確定的最優(yōu)提取工藝，對所選藜麥品種進(jìn)行提取，分析藜麥葉片黃酮得率的基因型差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

蘆丁在0～50.0 mg°L－1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，以吸光值(y)為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程:y=13.771x－0.013 6(R2=0.998 0)。該結(jié)果表明:蘆丁在該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)吸光度值與質(zhì)量濃度之間存在良好的線性關(guān)系。

2.2 最佳提取條件的確定

選用30%，70%和95%3個有代表性的乙醇體積分?jǐn)?shù)作為提取液。因乙醇沸點在80℃左右，采用水浴熱回流法(80～90℃)提取對它影響很小，因此，溫度因素可不考慮在內(nèi)。其他提取條件為提取時間和料液比。利用3因子3水平正交試驗研究各因素對工藝的影響，同時為明確影響提取得率的顯著性因子，對正交表中的黃酮得率作方差分析。結(jié)果分別見表1和表2。

由表2可知:FB＞F0.1，因素B對黃酮提取量的影響顯著，F(xiàn)0.2＜FA＜F0.1，因素A對黃酮提取量有一定的影響，但不顯著。由表1可知，RB＞RA＞RC，據(jù)此，可確定各因素對黃酮提取量影響主次順序為B＞A＞C。

2.2.1 浸提時間的選擇 由表1可知:提取時間為0.5 h時黃酮得率最高，其后逐漸降低。因此，提取時間以0.5 h為佳。延長浸提時間，可能由于黃酮降解，從而降低了提取量[8]。

2 藜麥總黃酮得率的方差分析Table 2 Variation analysis of extraction rate of flavonoids in quinoa

2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇 由表2可知:乙醇休積分?jǐn)?shù)對指標(biāo)具有一定的影響。根據(jù)表1和因素A的數(shù)據(jù)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%～70%時，黃酮得率劇增；而乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%～95%時，黃酮得率明顯下降，顯現(xiàn)一個拋物線變化的趨勢。因此，確定乙醇最佳體積分?jǐn)?shù)為70%。

2.2.3 料液比的選擇 由表2可知:料液比對指標(biāo)影響不顯著。當(dāng)對不同料液比進(jìn)行試驗時，發(fā)現(xiàn)料液比在1:40時，黃酮-得率略高于料液比為1∶60，其后隨著料液比的增加黃酮-得率逐漸降低。因此，從節(jié)約材料與藥品綜合比較后，確定最適料液比為1∶40。

綜上所述，藜麥總黃酮得率的最優(yōu)提取條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，浸泡時間0.5 h，料液比1∶40。

2.3 藜麥總黃酮得率的測定方法

根據(jù)已獲得的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性回歸方程，計算出每毫升提取液中的總黃酮含量，再根據(jù)公式計算總黃酮得率。為驗證比色法測定黃酮得率的可靠性，進(jìn)行了6次重復(fù)性試驗和回收率試驗。實驗結(jié)果顯示:在波長510 nm條件下，各重復(fù)實驗組的吸光度值分別為0.638，0.637，0.635，0.637，0.634，0.639。結(jié)果證明了比色法測定的可靠性；從回收率結(jié)果(表3)可以看出，本測定方法各處理的回收率均接近100%，重現(xiàn)性也較高。綜合上述，本法適用于測定藜麥黃酮類化合物的得率。

表3 藜麥黃酮分析的回收率實驗結(jié)果Table 3 Experimental results of recovery in extraction rate of flavonoids in quinoa

2.4 藜麥黃酮得率的基因型差異分析

表4列出了10個藜麥品種的黃酮得率。由表4可知:藜麥黃酮得率在基因型間存在很大差異，變幅為0.215%～0.933%，平均為0.619%，變異系數(shù)達(dá)34.44%。其中，以品種 ‘PI814932’的總黃酮得率最高，達(dá)0.933%。其次為 ‘QuinoaB.Rain Sow’和 ‘Temuco’，分別列第2位和3位，但兩者基因型黃酮得率差異不大。緊隨其后的分別是品種 ‘1591 Quinoa Cherry’和 ‘TEMUCO Quinoa TRADITIONAL’。品種 ‘Tomico Quinoa’和 ‘CQ-TEMVCC’的基因型黃酮得率相近，分別排列第8位和第9位。而葉片表面覆有紫色粉層的 ‘PI596498’品種的總黃酮得率最低，為0.215%，藜麥總黃酮得率可能與其葉片表面的紫色粉層有關(guān)。

3 討論與小結(jié)

黃酮類化合物因其獨特的保健功能而越來越得到人們的重視[8]。藜麥被認(rèn)為是最適宜人類的完美“全營養(yǎng)食品”，是最具潛力的農(nóng)作物之一。藜麥種子及新芽中的花青素、總多酚有較高的抗氧化性，可以作為傳統(tǒng)食物的替代品，具有很高的營養(yǎng)價值[22]。藜麥的葉子可當(dāng)蔬菜吃，與菠菜Spinacia oleracea葉子相似，既可用來涼拌生食，又是新鮮蔬菜的色拉的理想原料。本研究首次對藜麥的不同基因型品種的葉片黃酮得率進(jìn)行了測定比較。參照國內(nèi)外提取黃酮的多種方法[23－24]，紫外可見分光光度法操作簡單方便，標(biāo)準(zhǔn)對照品易得，結(jié)果可靠，是黃酮類化合物的定量分子最常用的方法之一[25]。本著溶劑無毒性、易回收、對黃酮溶解力強(qiáng)和工藝簡單的原則，確定乙醇為最佳提取劑。本研究表明，藜麥黃酮類化合物的提取率與乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間和料液比有關(guān)。經(jīng)采用3因素3水平正交試驗，其最佳提取工藝是乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取時間0.5 h，料液比1∶40，且一次提取即可使得率達(dá)85%以上，這為藜麥黃酮類化合物的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)和工藝參數(shù)。

表4 藜麥黃酮得率的基因型差異Table 4 Genotype variation of extraction yields of flavonoids in quinoa

黃酮得率的比色法測定比較簡單可靠，但易受脂類物質(zhì)的干擾[8]。從重復(fù)性試驗和回收率試驗中可看出，比色法適于測定藜麥總黃酮得率，且具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。說明藜麥葉片中含脂量不足以影響藜麥黃酮的提取和測定。研究表明: ‘PI814932’品種的黃酮提取量最高，達(dá)0.933%，該含量高于赪桐 Clerodendrum japonicum 根[24], 鮮 青 蒿 Artemisia carvifolia[26], 甜 菜 Beta vulgaris[27]等 的 黃 酮 含 量 。不同品種間藜麥葉片黃酮得率差異系數(shù)達(dá)34.44%，說明通過適當(dāng)?shù)挠N改良途徑和方法，可以篩選到高黃酮高抗氧化性藜麥品種。藜麥黃酮提取量還可能受葉片粉質(zhì)層的成分、葉片中葉綠素、花青苷、類胡蘿卜素含量[28]以及內(nèi)酯含量大小的遺傳和環(huán)境因子[29]等因素影響。本項目將對不同生長發(fā)育時期的藜麥葉片黃酮含量變化，以及葉片和種子黃酮含量的相關(guān)性作進(jìn)一步研究，更好地促進(jìn)藜麥作為一種保健的多功能多方面可利用的食物源的大力開發(fā)。

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