優(yōu)化的密度梯度離心法提取質(zhì)粒DNA

高英杰，趙紅桃

(河北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050024)

質(zhì)粒DNA是一種基因運(yùn)載工具，在分子生物學(xué)、基因工程中有著極為廣泛的應(yīng)用，作為質(zhì)粒載體有3個(gè)共同的特征：一個(gè)復(fù)制子、一個(gè)選擇性標(biāo)志和一個(gè)克隆位點(diǎn).而質(zhì)粒 DNA 的分離提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中最基本的工作.現(xiàn)在已經(jīng)建立了多種提取純化質(zhì)粒 DNA的方法[1]，這些方法都包括 3個(gè)步驟：培養(yǎng)細(xì)菌，收集和裂解細(xì)菌，純化質(zhì)粒DNA.由于質(zhì)粒的大小不同，收集質(zhì)粒的方法應(yīng)有所區(qū)別，大于15 kb的質(zhì)粒要用溫和的方法.小于15 kb的質(zhì)?？梢杂幂^劇烈的方法，有些大腸桿菌例如：HB101不能用加熱的方法裂解.分離純化質(zhì)粒的方法各有利弊，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求對(duì)所提純質(zhì)粒的純度也有所不同，通常提出的質(zhì)粒都存在一定量的RNA和菌體染色體DNA的污染[2].純化質(zhì)粒DNA最經(jīng)典的方法是氯化銫-溴化乙錠密度梯度離心法[3]，溴化乙錠可以插入DNA堿基之間，溴化乙錠與線狀DNA和閉環(huán)DNA結(jié)合有差別，在飽和溴化乙錠的氯化銫梯度溶液中線狀DNA的浮密度為1.54 g/cm3，閉環(huán)DNA的浮密度為1.59 g/cm3，所以離心的結(jié)果是線狀DNA和閉環(huán)DNA會(huì)停留在離心管的不同區(qū)域，從而將閉環(huán)DNA分離純化出來(lái).

氯化銫-溴化乙錠密度梯度離心具體還可以分為連續(xù)梯度和不連續(xù)梯度.區(qū)別在于氯化銫溶液濃度在離心管中是否連續(xù)，如果是一個(gè)連續(xù)的濃度梯度，例如加入10 mg/mL溴化乙錠的終濃度1.55 g/mL的氯化銫溶液，經(jīng)過(guò)超高速離心后會(huì)與 DNA、RNA等形成一個(gè)連續(xù)的濃度梯度，閉環(huán) DNA會(huì)懸浮于某一層，從而可以收集純化.不連續(xù)梯度是將3個(gè)不同濃度的氯化銫溶液逐一加至離心瓶中形成3種不同濃度氯化銫，這3種濃度的氯化銫并不混合，而是形成獨(dú)立的三層進(jìn)行離心.我們采用連續(xù)濃度梯度的方法對(duì)質(zhì)粒 DNA進(jìn)行分離，最終優(yōu)化出了一套純化方法，用氯化銫溴化乙錠連續(xù)密度梯度法可以得到理想的DNA，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn).

1 儀器與方法

1.1 儀器

日立超速離心機(jī)，型號(hào)CP100WX，轉(zhuǎn)頭型號(hào)SRP83VT.

1.2 方法

1) 配制試劑：溶液I(50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L pH 8.0 Tris-Cl，10 mmol/L pH 8.0 EDTA)，溶液Ⅱ(0.2 mol/L NaOH, 1 g/L SDS)，溶液Ⅲ(294 g/L 醋酸鉀, 115 mL/L冰醋酸)，EB溶液(10 mg/mL)，10 × SSC(1.5 mol/L NaCl, 0.15 mol/L檸檬酸鈉).

2) 接菌到試管中，搖到混濁后擴(kuò)培到1 L 2×YT培養(yǎng)基中，37 ℃ 搖培過(guò)夜；

3) 收集菌體，離心條件： 4 000 r/min，4 ℃，20 min，棄上清.加入25 mL溶液Ⅰ，振蕩重懸菌體；

4) 加入50 mL 溶液Ⅱ并緩慢顛倒，冰上放置2 min；

5) 加入40 mL溶液Ⅲ顛倒混勻，冰上放置5～10 min；

6) 離心：4 000 r/min，25 ℃，20 min.(可用玻璃棒輕輕打碎大塊的沉淀，以獲得更好的離心效果).離心后將上清用折疊成漏斗狀的miracloth(Millipore公司生產(chǎn))過(guò)濾到新的250 mL離心瓶中(過(guò)濾白色不溶物，減少蛋白和基因組DNA污染)，加入等體積的異丙醇，在室溫條件下沉淀15 min，靜置后可以見(jiàn)到絮狀沉淀；

7) 離心：12 000 r/min，4 ℃，10 min，棄去上清，沉淀用75 %乙醇洗2次，每次洗后均需離心3～5 min，離心后棄去上清；

8) 盡量吸干凈上清，晾干沉淀，加入4 mL超純水溶解，(可以用吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)吹5 s即可)，加純水后，若不易溶，可在37 ℃條件下促溶，由于質(zhì)粒濃度大，溶解后比較粘稠有拉絲現(xiàn)象；

9) 將4 mL質(zhì)粒溶液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，加入5.05 g氯化銫顛倒混勻，并使其充分溶解(氯化銫溶解過(guò)程中會(huì)吸熱，溶液會(huì)變涼，溶解后會(huì)產(chǎn)生絮狀物浮在液面，溶液為乳白色)；

10) 加入100 μL 100 mg/mL溴化乙錠(EB)溶液，混勻后離心：3 000 r/min，25 ℃，10 min，(液面上會(huì)有不溶物出現(xiàn))；

11) 將上清轉(zhuǎn)移到超速離心管中，(不建議使用移液器轉(zhuǎn)移，因?yàn)闀?huì)有很多氣泡出現(xiàn).可以改用注射器吸取并將上清轉(zhuǎn)移).離心：65 000 r/min，25 ℃，16 h；

12) 離心結(jié)束后，離心管中會(huì)出現(xiàn) 3個(gè)明顯的紅色條帶，最上一層為蛋白質(zhì)，中間一層為缺口環(huán)狀和線狀DNA，最下一層條帶為我們的目的條帶閉環(huán)質(zhì)粒DNA，將質(zhì)粒約2～3 mL吸到15 mL離心管中(吸前先將超速離心管的頂部扎一小孔進(jìn)氣，方便后續(xù)吸取質(zhì)粒層).然后加入10 × SSC平衡好的異戊醇，混勻，靜置分層后將上層吸出棄去以便抽提溴化乙錠.

13) 重復(fù)上一步驟直到質(zhì)粒溶液透明無(wú)色，將上層的異丙醇去除干凈；

14) 將250 μL質(zhì)粒溶液吸到2 mL離心管中，加4倍體積70 %乙醇，混勻后室溫沉淀20 min；

15) 離心：1 200 r/min，25 ℃，10 min，棄上清，70 %乙醇洗滌沉淀；

16) 離心后將上清吸干，晾干沉淀，每管加入200 μL超純水溶解.

2 結(jié)果與分析

由圖1和圖2可以看出，用氯化銫-溴化乙錠密度梯度離心法提取的質(zhì)粒DNA純度明顯高于普通的質(zhì)粒小量抽提試劑盒所提取的質(zhì)粒DNA，通過(guò)超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)得質(zhì)粒DNA質(zhì)量濃度分別為500 ng/μL和 100 ng/μL.圖 1電泳圖所示氯化銫密度梯度離心獲得的瓊脂糖凝膠電泳亮度明顯高于普通的質(zhì)粒小量提取試劑盒得到的質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳.對(duì)于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，我們對(duì)擬南芥原生質(zhì)體進(jìn)行雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，圖 2所示用密度梯度離心法提取的質(zhì)粒DNA可以達(dá)到60 %～70 %的轉(zhuǎn)化率，而普通的質(zhì)粒小量抽提試劑盒用于擬南芥轉(zhuǎn)化最好只有10 %的轉(zhuǎn)化效率.

圖1 質(zhì)粒電泳檢測(cè)

圖1A為用氯化銫密度梯度離心獲得的不同構(gòu)建的質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳.

圖1B為用普通的質(zhì)粒小量提取試劑盒得到的質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳.

圖 1A一個(gè)融合 YFP的基因，通過(guò)氯化銫密度梯度離心獲得的高純度的質(zhì)粒，用于擬南芥原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率約為60 %～70 %，效率較高.

圖1B為用普通的質(zhì)粒小量提取試劑盒得到的質(zhì)粒用于擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率僅為10 %左右.

圖2 質(zhì)粒質(zhì)量鑒定-原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

3 討論

影響氯化銫-溴化乙錠密度梯度離心法提取質(zhì)粒DNA因素及應(yīng)注意的事項(xiàng)如下：

1) 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用到氯化銫及溴化乙錠均為有毒試劑，必須戴手套，減少與皮膚直接接觸.

2) 離心的次數(shù)較多，還需用到超速離心，一定要在專業(yè)人員培訓(xùn)后方可操作，以免發(fā)生事故.

3) 離心結(jié)束后，吸取質(zhì)粒DNA時(shí)一定要注意，吸前先將超速離心管的頂部扎一小孔進(jìn)氣，方便后續(xù)吸取質(zhì)粒層.

4) 對(duì)質(zhì)粒DNA要及時(shí)進(jìn)行抽提，過(guò)夜或長(zhǎng)時(shí)間放置都會(huì)導(dǎo)致EB不容易抽提出來(lái).

5) 異丙醇有刺激性氣味，進(jìn)行異丙醇去處操作時(shí)最好在通風(fēng)櫥中進(jìn)行.

[1] 李亮,蔡志強(qiáng),趙希岳.細(xì)菌質(zhì)粒DNA的快速提取及檢測(cè)[J].江蘇工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào),2003,15(3):30-31.

[2] 黃南,程熠,連歡,等.改進(jìn)溶液 II配方可提高質(zhì)粒 DNA 提取的質(zhì)量及得率[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2008,37(6):816-818.

[3] J·薩姆布魯克, D·W·拉塞爾.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南:上[M].黃培堂,譯.北京:科學(xué)出版社,2002:53-58.