豬輪狀病毒L1株VP7基因克隆及序列分析

陳曉春，王繼文，吳華偉* ，蔡青秀，鄧 永，高金源，郎洪武

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081;2.北京出入境檢驗檢疫局，北京100026)

豬輪狀病毒(Porcine Rotavirus，PRV)屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)輪狀病毒屬［1］(Rotavirus)，是引起仔豬嚴重腹瀉的主要病原之一，能引起仔豬腹瀉、厭食、嘔吐、脫水等癥狀，仔豬機體免疫力急劇下降，常誘發(fā)多種疾病的繼發(fā)感染，導致仔豬死亡或生長遲緩，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失［2］。

RV粒子無囊膜，具有雙層衣殼結構，基因組由11個不連續(xù)雙股正鏈RNA片段組成，分別編碼6種結構蛋白和5種非結構蛋白。VP7是一種糖基化蛋白，由326個氨基酸組成，因毒株的不同，可由7、8或9基因編碼，與VP4蛋白一起構成病毒粒子的最外層核衣殼，是病毒的主要中和抗原，在病毒檢測、分型、產(chǎn)生中和抗體及免疫性保護過程中具有重要意義［2］。輪狀病毒根據(jù)群特異性(由群抗原VP6決定)可分為7個群(A～G)，其中可感染豬的有A、B、C和E4個群，以A群為主。根據(jù)VP7蛋白血清學特性，又可將A群輪狀病毒分為不同的G血清型(glycoprotein-sensitive)，而不同血清型之間的交叉保護作用甚微［3］。A群輪狀病毒已被證實至少存在26個G型［5］。其中豬輪狀病毒至少有12個 G 型(G1-G6，G8-G12，G26)。我國自 20世紀80年代初發(fā)現(xiàn)豬輪狀病毒病以來，與豬流行性腹瀉病和豬傳染性胃腸炎病一起被視為造成仔豬病毒性腹瀉的三大頑疾。目前，我國尚沒有針對豬輪狀病毒的商品化疫苗，對于該病的預防仍是空白。本研究將新近分離到的一株豬輪狀病毒進行了VP7基因的克隆及序列分析，并根據(jù)2008年RCWG(Rotavirus Classification Working group)發(fā)布的輪狀病毒基因型分類方法［4］進行了基因型的鑒定，為進一步了解我國豬輪狀病毒的流行情況，研制安全有效的疫苗提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 毒株 豬輪狀病毒L1株病毒，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所病毒制品檢測室分離鑒定［6］。豬輪狀病毒陽性對照(AV59)［7］，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心提供。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶等購自Gibco公司;Ex Taq聚合酶、dNTP、瓊脂糖、DNA marker DL2000等為 TaKaRa公司產(chǎn)品;Go-Taq?Green Master Mix為Promega公司產(chǎn)品;反轉錄酶、RNA酶抑制劑、TRIzol試劑盒購自invitrogen公司;DNA純化試劑盒購自Omega公司;其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 引物設計與合成 根據(jù)GenBank公布的豬輪狀病毒VP7基因序列設計1對引物，序列分別為P1:5’-ATGTATGGTATTGAATATACCACA-3’;P2:5’-GGTCACATCATACAATTCTAATCTA-3’，用于擴增VP7基因。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.4 VP7基因克隆及序列分析 取豬輪狀病毒L1株病毒液按Trizol試劑盒說明書方法進行RNA抽提，經(jīng)反轉錄程序后，進行PCR擴增。反應條件為:94℃預變性5 min，94℃變性45 s、55℃退火45 s、72℃延伸1 min、35個循環(huán)，72℃后延伸 10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下觀察結果。經(jīng)鑒定的產(chǎn)物送北京六合華大基因科技股份有限公司進行序列測定。利用DNAStar軟件對測定的序列進行分析。參考序列信息見表1。

表1 比對參考序列信息

2 結果與分析

2.1 VP7基因的擴增 以L1株病毒液反轉錄cDNA為模板，進行VP7基因PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察，分別可見約1062 bp左右特異性目的條帶，與預期結果相符(圖1)。

圖1 豬輪狀病毒L1株VP7基因擴增結果

2.2 序列分析及基因型的鑒定 經(jīng)測序證實獲得了豬輪狀病毒L1株VP7基因全長序列，共1062 bp，包括5’端非編碼區(qū)48 bp，3’端非編碼區(qū)33 bp，中間為一個完整的ORF，共981 bp，編碼326個氨基酸。按照RCWG公布的輪狀病毒基因分型方法進行基因分型(圖2右上)，結果顯示L1株與經(jīng)典的G5型毒株OSU、A34、134-04-15和344-04-1同源性最高，在88.8% ～93.7%之間，由此推測L1株為G5型豬輪狀病毒。與GenBank上中國分離的其他毒株序列的比較發(fā)現(xiàn)，L1株與ZJhz13-2株同源性最高，為97.8%，與近幾年分離的G9型豬輪狀病毒(NMTL株)同源性較低，為77.7%。核苷酸推導的氨基酸序列分析結果(圖2左下)顯示，L1株與G5型毒株間同源性都在93.3%以上，與同型的中國分離株ZJhz13-2株同源性為96%，與G9型NMTL株推導的氨基酸同源性為82%，各毒株間氨基酸同源性普遍高于核苷酸同源性，說明同型豬輪狀病毒基因的有意突變僅發(fā)生在有限的區(qū)域。

通過抗原表位分析(圖3)發(fā)現(xiàn)，L1株VP7蛋白抗原表位與 G9型毒株在 aa25～aa29、aa86～aa102、aa142 ～ aa152、aa211 ～ aa226、aa263 ～ aa286等區(qū)域存在明顯不同，可能是兩個血清型間存在抗原差異的原因。

核苷酸系統(tǒng)進化樹分析結果(圖4)表明，L1株、2012年中國分離株ZJhzI3-2同屬一個分支，并與G5型代表株同屬一個群，進一步證實L1毒株血清型為G5型。

3 討論

圖2 PRV VP7基因核苷酸序列與推導的氨基酸序列同源性比較

圖3 PRV L1株VP7與G9型毒株間抗原表位分析與比較

圖4 PRV VP7核苷酸系統(tǒng)進化樹分析

VP6基因是最先用于輪狀病毒分型的基因片段［4］。采用VP6上不同抗原表位的單克隆抗體可將輪狀病毒分為SGI、SGII、SGI+II、SGI-、SGII-［8］，通過分子生物的方法對比發(fā)現(xiàn)［9］，SGI單獨屬于基因 I型，而 SGII、SGI+II、SGI-、SGII-共同屬于基因II型。直到20世紀90年代末，人們開始認識到單單通過一種因素很難界定輪狀病毒的亞型。通過血清學試驗發(fā)現(xiàn)，VP4和VP7均能獨立誘導機體產(chǎn)生中和抗體，通過VP4和VP7雙重標準可將輪狀病毒分為P型(protease-sensitive)和G型(glycoprotein-sensitive)［10］。但由于通過血清學方法進行分型需要收集、制備和鑒定大量的參照毒株及特異性血清，給新毒株的分型帶來極大的困難，因此，采用基因序列分析進行分型越來越受到人們關注。2008年，RCWG(Rotavirus Classification Working group)發(fā)布了輪狀病毒基因型分類方法［5］，分別以 Gx-P［x］-Ix-Rx-Cx-Mx-Ax-Nx-Tx-Ex-Hx代表VP7-VP4-VP6-VP1-VP2-VP3-NSP1-NSP2-NSP3-NSP4-NSP5/6基因型，并規(guī)定了各片段同源性分別在80%、80%、85%、83%、84%、81%、79%、85%、85%、85%、91%以上者可確定為同一基因型。其中G基因型與G血清型基本一致，P基因型和血清型有所不同，一般是在P血清型基礎上增加［x］以表示其基因型［5］。

本研究參考RCWG分類法將PRVL1株鑒定為G5型豬輪狀病毒。在2005年以前我國及日本、泰國等東南亞國家以G3、G5流行為主，之后陸續(xù)有G9、G10和G11型毒株流行的報道，但我國目前仍以G5和G9型為主［3］。據(jù)報道，VP7基因存在高變區(qū)［11］，且涉及到中和抗原位點的編碼，不同型的輪狀病毒間交叉保護性較差，并且不同血清型毒株混合感染同一宿主時，可能發(fā)生基因交換、交叉或重排［12］。本文通過抗原表位分析發(fā)現(xiàn)，L1株與我國近年來分離到的G9型豬輪狀病毒的VP7的抗原表位上存在一定的差異，是否對兩個基因型交叉保護效果存在影響還需進一步研究。

VP7是輪狀病毒主要的免疫保護性抗原，在刺激機體產(chǎn)生中和抗體，清除病毒感染方面具有重要的作用。因此，針對VP7進行分型具有重要的意義，能為該病的有效防治提供重要的依據(jù)和參考。

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