ELISA在口蹄疫監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展

厙大亮，陳前鋒，武革利，厲少漢

(1.楊凌綠方生物工程有限公司，陜西楊凌712100;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州730000;3.石家莊市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，石家莊050000)

口蹄疫病毒(FMDV)有7個(gè)血清型，每個(gè)型又可分為若干個(gè)亞型，血清型間幾乎無交叉免疫反應(yīng)，同型內(nèi)部不同毒株之間抗原性也有差異，這就給口蹄疫(FMD)的診斷和防治工作帶來很大難度。在世界各地，因流行病毒血清型不同，使用的疫苗毒株也不同，流行毒株的抗原變異往往導(dǎo)致免疫失敗，同時(shí)由于感染動(dòng)物抗體和免疫動(dòng)物抗體情況很接近，使得區(qū)分免疫動(dòng)物群體中的感染動(dòng)物時(shí)情況非常復(fù)雜［1］。ELISA是最常用于診斷FMD的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)，具有靈敏、廉價(jià)、快速且易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作等優(yōu)點(diǎn)，不僅適用于大量臨床標(biāo)本的檢測(cè)，也適合血清流行病學(xué)調(diào)查。本文對(duì)ELISA方法在FMD診斷、FMDV的血清型和基因型分析、病毒粒子定量等方面國(guó)內(nèi)外近期的研究進(jìn)展和發(fā)展趨勢(shì)做了論述。

1 ELISA在口蹄疫診斷中的應(yīng)用

FMD與水皰型疾病很難通過臨床診斷加以區(qū)分，雖然可以用病毒分離、RT-PCR來診斷，但是費(fèi)時(shí)費(fèi)力;ELISA操作方便，價(jià)格低廉，可以同時(shí)檢測(cè)大量樣品，所以ELISA已成為FMD診斷中應(yīng)用最為廣泛的血清學(xué)技術(shù)之一。

血清多抗經(jīng)常出現(xiàn)品質(zhì)不均勻和交叉反應(yīng)較多的情況，所以使用血清多抗的ELISA很難實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和程序化。與血清多抗相比，單克隆抗體具有均一且特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，是建立ELISA的最佳選擇。孫靜等［2］使用抗A型FMDV單克隆抗體建立了檢測(cè)A型FMDV的抗原捕獲ELISA，該方法可以檢出2.0 ng的純化FMDV。Chen等［3］報(bào)道了一種單克隆抗體ELISA，此法對(duì)O型FMDV非常敏感，而與Asia I、A及C型病毒均不反應(yīng)。為提高敏感性，近年來出現(xiàn)了能夠檢測(cè)痕量物質(zhì)的RT-PCR ELISA［4］，這種 ELISA 敏感性極高，對(duì)診斷臨床癥狀不明顯的感染動(dòng)物效果很好。

為防止FMDV擴(kuò)散，過去常使用融合蛋白和多肽代替完整病毒作為抗原建立ELISA。有研究證明［5］，VP1蛋白在ELISA檢測(cè)中更準(zhǔn)確，能將假陽(yáng)性率降到最低。于軍超等［6］用Rosetta菌表達(dá)重組VP1作為抗原建立了檢測(cè)O型FMDV抗體的間接ELISA，此法與液相阻斷試劑盒符合率為98.87%。為了擴(kuò)大試劑盒的應(yīng)用范圍，Yang等［7］制備了針對(duì)保守區(qū)域1B蛋白N末端的單克隆抗體來開發(fā)跨型診斷試劑盒。

融合蛋白雖然避免了散毒風(fēng)險(xiǎn)，但僅有線性表位而缺少構(gòu)象表位，不能完全代替完整病毒顆粒，而空衣殼含有連續(xù)和間斷的B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位，結(jié)構(gòu)與完整病毒極為相似。目前FMDV不同血清型的空衣殼均已通過大腸桿菌或者桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得，Basagoudanavar等［8］通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得了A型FMDV結(jié)構(gòu)蛋白，然后在昆蟲細(xì)胞內(nèi)組裝成空衣殼，用以建立液相阻斷ELISA，此法與傳統(tǒng)液相阻斷ELISA的相關(guān)性為89%。作為融合蛋白和病毒顆粒的替代品，空衣殼已成為FMD診斷方法和疫苗研究的新熱點(diǎn)。

2 ELISA在區(qū)別疫苗免疫動(dòng)物和感染動(dòng)物中的應(yīng)用

近幾年來基因工程疫苗被廣泛研發(fā)，但由于存在諸多問題，商品化的產(chǎn)品比較少。而滅活疫苗效果良好，在發(fā)展中國(guó)家和地區(qū)仍然是防控FMD的最佳工具。一般情況下滅活疫苗在生產(chǎn)過程中的抗原純化環(huán)節(jié)除去了絕大部分非結(jié)構(gòu)蛋白，免疫動(dòng)物幾乎不產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，而自然感染動(dòng)物既產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白抗體又產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白抗體。學(xué)者們據(jù)此認(rèn)為檢測(cè)非結(jié)構(gòu)蛋白抗體對(duì)于區(qū)別免疫動(dòng)物與感染動(dòng)物具有重要意義，于是一些檢測(cè)FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白抗體的ELISA應(yīng)運(yùn)而生。

2.1 3 D非結(jié)構(gòu)蛋白ELISA 3D非結(jié)構(gòu)蛋白屬于RNA聚合酶的核心成分，主要作用是蛋白裂解和蛋白折疊。在所有7種血清型中3D蛋白具有高度的保守性，因此理論上講使用3D蛋白可以檢測(cè)全部七種血清型病毒的感染。3D蛋白是第一種用于免疫動(dòng)物群體中檢測(cè)感染動(dòng)物的非結(jié)構(gòu)蛋白，過去3D蛋白來源于病毒培養(yǎng)物，但這樣獲得的蛋白在實(shí)際使用中可重復(fù)性不強(qiáng)，現(xiàn)在ELISA通常使用人工表達(dá)的方法獲得3D蛋白。但也有研究表明，多次注射疫苗的動(dòng)物體內(nèi)也能夠檢測(cè)到3D抗體，這說明要從免疫動(dòng)物中區(qū)分感染動(dòng)物，在檢測(cè)3D抗體的同時(shí)還應(yīng)當(dāng)檢測(cè)其他非結(jié)構(gòu)蛋白抗體以提高準(zhǔn)確性。

2.2 3 B非結(jié)構(gòu)蛋白ELISA 3B蛋白即通常所說的VPg蛋白，是一種病毒基因組綁定蛋白，它共價(jià)結(jié)合于基因組5’末端，作用是幫助病毒基因組做初步的折疊。另外VPg蛋白的拷貝數(shù)與宿主范圍以及病毒毒力有關(guān)。國(guó)內(nèi)最近報(bào)道了一種阻斷ELISA［9］，此方法使用組氨酸單抗作為捕獲抗體，3B單抗作為檢測(cè)抗體，具有較為理想的檢測(cè)效果。Gao等［10］設(shè)計(jì)了含有3B蛋白中三個(gè)B細(xì)胞線性表位的基因序列，并用大腸桿菌表達(dá)得到一種八聚體串聯(lián)重復(fù)序列蛋白，以此蛋白建立間接ELISA，敏感性為96.8%，特異性為99%。

2.3 3 ABC非結(jié)構(gòu)蛋白ELISA 3ABC蛋白在FMDV感染細(xì)胞裂解物中含量極低，并具有很強(qiáng)的免疫原性，所以理論上3ABC蛋白非常適合在ELISA中做抗原使用。有學(xué)者分別使用2C、3A、3B、3D和3ABC作為抗原，建立間接ELISA檢測(cè)感染牛血清，結(jié)果標(biāo)明3ABC間接ELISA效果最好［11］。過去絕大多數(shù)ELISA都是用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)提供3ABC，為了使表達(dá)蛋白的構(gòu)象接近自然蛋白，人們發(fā)明了桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。2003年Kweon等［12］開發(fā)了一種間接捕獲ELISA，此法使用桿狀病毒表達(dá)的3ABC蛋白以及3A單克隆抗體。由于抗原捕獲可以起到凈化蛋白的作用，Srisombundit等［13］用昆蟲細(xì)胞表達(dá)了組氨酸標(biāo)記的全長(zhǎng)3C-3ABC蛋白，以此蛋白建立了單抗捕獲間接ELISA，此法的特異性為96.6%，敏感性為84%。Clavijo等［14］建立了一種生物素化 3ABC競(jìng)爭(zhēng)ELISA，此法可以廣泛用于不同動(dòng)物和不同血清型。還有其他多種檢測(cè)3ABC抗體的間接，競(jìng)爭(zhēng)或者阻斷ELISA用于實(shí)踐，事實(shí)證明這些方法都有良好的效果［15］。2007 年，F(xiàn)oord 等［16］提出了一種使用細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)的競(jìng)爭(zhēng)ELISA，用噬菌體展示技術(shù)獲得重組抗體的單鏈可變片段，同大腸桿菌表達(dá)的3ABC蛋白反應(yīng)，這個(gè)實(shí)驗(yàn)揭示了單鏈抗體片段在ELISA中有代替單克隆抗體的可能。

3 ELISA在口蹄疫流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用

臨床上經(jīng)常出現(xiàn)因流行毒株與制苗毒株之間亞種不同，使得疫苗免疫后保護(hù)率較差，因此有必要使用流行病學(xué)方法連續(xù)對(duì)田間流行毒株與制苗毒株的親緣性進(jìn)行比較，既可評(píng)價(jià)制苗種毒的效力，也可為選用合適的制苗種毒提供依據(jù)。

流行病學(xué)調(diào)查的重點(diǎn)在于區(qū)分對(duì)保護(hù)性免疫應(yīng)答有意義的抗原表位，以及尋找在血清型及血清亞型之間變化的和保守的抗原表位。傳統(tǒng)分析線性抗原表位方法都非常繁瑣，1985年McCullough等報(bào)道了用液相ELISA鑒定FMDV抗原表位的方法，之后使用ELISA鑒別抗原位點(diǎn)的方法發(fā)展很快，各國(guó)的學(xué)者們使用單個(gè)或重復(fù)多肽位點(diǎn)的ELISA廣泛分析VP1、VP2、VP3、VP4蛋白，并建立了抗原位點(diǎn)圖。最近有文章［17-18］描述了使用重疊肽ELISA鑒別與感染有關(guān)的B細(xì)胞及T細(xì)胞抗原位點(diǎn)的方法。

由于單克隆抗體只針對(duì)某特定區(qū)域，現(xiàn)在大量的病毒都使用基于單克隆抗體的簡(jiǎn)單ELISA模式分析抗原表位，原理是毒株間不與單克隆抗體反應(yīng)的毒株缺少與單抗對(duì)應(yīng)的抗原表位。Aggarwal等［19］對(duì)牛、羊和豬注射O型FMDV血清亞型疫苗后，采血清用單克隆抗體研究不同抗原表位特異性，此實(shí)驗(yàn)使用競(jìng)爭(zhēng)ELISA模式，研究發(fā)現(xiàn)VP1羧基末端在反芻動(dòng)物是有效的抗原表位，但在豬卻無法識(shí)別。從理論上講多種單克隆抗體聯(lián)合使用使得病毒至少有一個(gè)抗原表位被抗體辨認(rèn)出，增加了ELISA在表位分析中的準(zhǔn)確性，這將是以后ELISA研究的方向之一。

4 ELISA在病毒及蛋白定量中的應(yīng)用

滅活疫苗的免疫原性主要來源于146S病毒完整顆粒，因此檢測(cè)疫苗中病毒顆粒完整性非常重要。過去FMDV定量及完整性檢測(cè)常用氯化銫或者蔗糖密度梯度離心法，此方法耗時(shí)耗力、需要昂貴的設(shè)備，并且不能判斷獲得的病毒是否已被蛋白酶水解。如果能制備針對(duì)146S構(gòu)象表位的單克隆抗體，這種單抗只與完整病毒反應(yīng)而不與蛋白亞單位反應(yīng)，則使用這種單抗建立的ELISA不僅能夠定量146S完整顆粒，而且能在不同疫苗生產(chǎn)模式下檢測(cè)病毒顆粒完整性。Yang等［20］采用針對(duì) O、A血清型的兩種單克隆抗體建立了夾心ELISA，對(duì)FMDV完整病毒粒子進(jìn)行定量，此法將檢測(cè)146S抗原顆粒的精確性提升到了ng級(jí)別。

為驗(yàn)證滅活疫苗中的非結(jié)構(gòu)蛋白含量是否超標(biāo)，需要用疫苗多次免疫易感動(dòng)物，然后檢測(cè)血清中非結(jié)構(gòu)蛋白抗體含量，這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且需要大量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，因此非常昂貴。Capozzo等［21］開發(fā)了一種過濾輔助化學(xué)分析 ELISA(FAL-ELISA)，能夠直接對(duì)FMD滅活疫苗中的非結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行定量，此方法檢測(cè)純化的非結(jié)構(gòu)蛋白含量誤差為2 ng，檢測(cè)疫苗中非結(jié)構(gòu)蛋白含量誤差為4 ng，F(xiàn)AL-ELISA的特點(diǎn)在于省時(shí)且廉價(jià)。

5 總結(jié)與展望

通過比較近年來有關(guān)ELISA的報(bào)道，我們發(fā)現(xiàn)ELISA的研究趨勢(shì)一是與單克隆抗體、RT-PCR等技術(shù)聯(lián)合使診斷更加準(zhǔn)確;二是簡(jiǎn)化操作步驟，增加自動(dòng)化程度，使其更加方便快捷。在所有ELISA模式中，抗原捕獲、阻斷、競(jìng)爭(zhēng)以及夾心ELISA有很高的特異性，而RT-PCR ELISA具有很高的敏感性;作為ELISA中重要的試劑，針對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白的單克隆抗體被大量制備，單克隆抗體既可作為捕獲抗體也可做檢測(cè)抗體，還可以與過氧化物酶結(jié)合使用;多種單克隆抗體結(jié)合以及單克隆抗體與血清多抗結(jié)合都是是比較好的抗體聯(lián)合方式［22］。檢測(cè)非結(jié)構(gòu)蛋白抗體的ELISA可以從疫苗免疫動(dòng)物群體中檢測(cè)感染動(dòng)物，但因?yàn)槊舾行暂^低，僅檢測(cè)一種非結(jié)構(gòu)蛋白抗體的ELISA并不能準(zhǔn)確分辨［23］，有鑒于此，國(guó)際上普遍認(rèn)為可以通過同時(shí)檢測(cè)多種非結(jié)構(gòu)蛋白抗體來增加檢測(cè)的準(zhǔn)確性。有些ELISA在研發(fā)階段檢測(cè)效果非常好，但是經(jīng)過規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用到實(shí)踐當(dāng)中檢測(cè)效果卻不理想，這涉及到生產(chǎn)工藝改進(jìn)，血清稀釋液研發(fā)等諸多問題，而此類研究的相關(guān)資料很少，將是今后ELISA研發(fā)的重要方向。

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