雞傳染性法氏囊病活疫苗(B87株)病毒含量細胞間接免疫熒光方法的建立

李 翠，郭彩云，戴志紅，蔣 卉，張秀英，溫 芳，陸連壽，王在時

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

雞傳染性法氏囊病(Infectious of bursal disease，IBD)是由雞傳染性法氏囊病毒(Infectious of bursal disease virus，IBDV)引起的一種急性、高度傳染性疾?。?］。在我國對該病的主要防治措施是對雞群進行疫苗免疫，而疫苗質(zhì)量的好壞直接關乎免疫預防的成敗。雞傳染性法氏囊病活疫苗(B87株)作為國內(nèi)最常使用的雞傳染性法氏囊病疫苗，目前主要采用雞胚半數(shù)致死量(ELD50)測定法測定該疫苗的病毒含量以確定其效力［2］。由于SPF雞胚價格高，且病毒含量測定所需的周期較長，使得檢驗成本增加，因此建立一種更加經(jīng)濟、快速測定該疫苗病毒含量的方法具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，雞傳染性法氏囊病毒在原代雞胚成纖維細胞(CEF)、Vero細胞等都有很好的適應性［3］，但不產(chǎn)生明顯的細胞病變，可以通過熒光染料染色后呈現(xiàn)強烈的熒光。試驗采用Vero細胞建立細胞免疫熒光方法，確定了高免血清及二抗適宜稀釋濃度、接度量和方法的特異性，并與傳統(tǒng)雞胚半數(shù)致死量(ELD50)方法進行了敏感性和相關性比較，細胞免疫熒光方法具有更高的敏感性，且兩種方法具有良好的相關性。本研究為今后該疫苗的病毒含量測定提供了一個新途徑。

1 材料

1.1 疫苗和細胞 雞傳染性法氏囊病毒為本研究室制備的雞傳染性法氏囊病活疫苗(B87株)參考品(批號:S0531111);Vero細胞由華中農(nóng)業(yè)大學實驗室贈予;SPF雞胚，梅里亞維通實驗動物技術有限公司。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、犢牛血清、0.25%胰酶，Gibco公司;0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS);丙酮、甲醇，北京化學試劑公司;雞傳染性法氏囊病陰、陽性血清(批號:2010)，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心;羊抗雞IgG(產(chǎn)品編號:bs-0310GAF488)，北京博奧森生物技術有限公司。

2 方法

2.1 病毒接種 將Vero細胞接種48孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)至單層，棄去培養(yǎng)液，接種雞傳染性法氏囊病毒液，培養(yǎng)48 h。

2.2 間接免疫熒光(IFA)試驗 參照文獻［4］進行。一抗為中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所研制的雞傳染性法氏囊病毒高免血清，二抗為羊抗雞IgG，同時設陰性血清、生理鹽水和不接毒加陽性高免血清三組對照。

2.3 高免血清及二抗適宜稀釋濃度的確定 用0.01mol/L pH7.4的PBS緩沖液對羊抗雞IgG熒光抗體作1∶100、1∶200、1∶300、1∶400 系列稀釋，每孔100 μL，分別與用生理鹽水作1∶100稀釋的雞傳染性法氏囊病高免血清反應，以確定熒光抗體適宜濃度;用生理鹽水將雞傳染性法氏囊病高免血清作1∶50、1∶100、1∶200、1∶300 系列稀釋，每孔100 μL，分別與適宜濃度的熒光抗體進行反應，以確定雞傳染性法氏囊病高免血清的適宜稀釋度。

2.4 接毒量的確定 分別將每0.2 mL病毒含量ELD50值為104.5的疫苗液10倍系列稀釋得每0.2 mL 病毒含量 ELD50值為 103.5、102.5、101.5、100.5的稀釋液，每孔分別接種0.2、0.1和0.05 mL，各接種三塊48孔板，48 h后固定染色，熒光顯微鏡下觀察結果。

2.5 特異性試驗 長成單層的Vero細胞，分別接種雞傳染性支氣管炎病毒、雞新城疫病毒、禽白血病病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒，同時設接種雞傳染性法氏囊病毒和正常細胞對照，固定染色，在熒光顯微鏡下觀察。

2.6 敏感性試驗 隨機抽取5支半數(shù)致死量對數(shù)值(lgELD50)定值為4.19±0.15的雞傳染性法氏囊病活疫苗(B87株)，分別稀釋至每0.2 mL病毒含量 ELD50值為 103.5、102.5、101.5、100.5，在單層Vero細胞板上每孔分別接種各稀釋度的疫苗液200 μL，各5孔，培養(yǎng) 48 h后，固定染色，在熒光顯微鏡下觀察結果。按Reed法計算TCID50值，并按平均值±標準偏差定值樣品的lgTCID50值，以比較兩種方法的敏感性。

2.7 ELD50和TCID50方法測定疫苗病毒含量的比較 隨機抽取10支雞傳染性法氏囊病活疫苗(B87株)，做10倍系列稀釋，取適宜稀釋度分別定量接種單層Vero細胞和SPF雞胚，每個稀釋度接種5個重復。接毒細胞培養(yǎng)48 h，固定染色，在熒光顯微鏡下觀察結果，“++”及以上結果判為陽性，計算各稀釋度出現(xiàn)特異性熒光的百分率。接毒雞胚培養(yǎng)7 d，觀察結果。按Reed法分別計算ELD50值和 TCID50值。并采用 SAS軟件對 ELD50值和TCID50值進行相關性分析。

3 結果

3.1 細胞間接免疫熒光方法的建立試驗結果 接種0.05 mL病毒含量為102.5ELD50/0.2 mL的細胞孔中無陽性熒光，0.2mL組和0.1 mL組對應各細胞孔熒光無明顯差別，因此接毒量選擇每孔接種0.1 mL(圖1)。

3.2 高免血清及二抗適宜稀釋濃度的確定 將高免血清與各稀釋度二抗進行棋盤式組合試驗，結果表明，1∶200稀釋度的高免血清與1∶300稀釋度的二抗組合時，觀察到的熒光最清晰，而降低或增加高免血清和二抗?jié)舛葧r，觀察到的熒光均不很清晰(圖2)。

3.3 特異性試驗 雞傳染性法氏囊病毒檢測結果為陽性，雞傳染性支氣管炎病毒、雞新城疫病毒、禽白血病病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒和正常細胞對照未見熒光，均為陰性。

3.4 敏感性試驗 細胞間接免疫熒光方法敏感試驗結果見表1，數(shù)據(jù)結果匯總見表2。

按Reed法計算5支樣品的TCID50值，其對數(shù)值(lgTCID50)值分別為:5.67、5.60、5.75、5.37、5.56。按平均值±標準偏差定值樣品的lgTCID50值結果為:5.59±0.14。與半數(shù)致死量的對數(shù)值(lgELD50)的定值結果4.19±0.15比較可見，該方法穩(wěn)定，具有更高的敏感性。

圖1 接毒量實驗結果

圖2 高免血清及二抗適宜稀釋濃度的確定

表1 細胞間接免疫熒光敏感性試驗結果

表2 細胞間接免疫熒光敏感性試驗結果統(tǒng)計

表3 lgELD50與lgTCID50對數(shù)值的對比結果

3.5 ELD50值與TCID50值相關性的對比 隨機抽取的10支雞傳染性法氏囊病活疫苗(B87株)，以傳統(tǒng)的ELD50方法與TCID50方法同時測定病毒含量。試驗結果見表3。

傳統(tǒng)ELD50方法測定值為A組數(shù)據(jù)，間接免疫熒光TCID50方法測得值為B組數(shù)據(jù)，A組平均數(shù)(Mean)＝3.74，B組平均數(shù)(Mean)＝5.54，說明TCID50方法具有更高的檢驗靈敏度。采用SAS軟件對兩組數(shù)據(jù)進行相關性分析［5］，相關系數(shù)r＝0.83944，當0.7≤︳r︳≤1為高度相關，因此，傳統(tǒng)ELD50方法和間接免疫熒光TCID50方法測定疫苗病毒含量值具有高度的相關性。

4 討論

研究建立了細胞間接免疫熒光測定雞傳染性法氏囊病活疫苗(B87株)病毒含量的方法，將毒液進行10倍系列稀釋，感染單層Vero細胞，加高免血清、羊抗雞IgG熒光抗體，根據(jù)細胞板中熒光斑來判定陰陽性，并計算半數(shù)細胞感染量(TCID50)。細胞免疫熒光試驗中，高免血清與熒光抗體的濃度確定，對實驗結果的判定至關重要。二者的濃度過高會使背景熒光過重，而導致假陽性結果的出現(xiàn)，二者濃度過低，則會使視野內(nèi)熒光斑數(shù)量減少，而導致假陰性結果出現(xiàn)。本研究確定了該方法中高免血清與熒光抗體的適宜濃度，保證實驗出現(xiàn)低背景、高熒光斑的結果，利于觀察，從而使實驗結果客觀準確。

研究提供了測定雞傳染性法氏囊病活疫苗(B87株)病毒含量的新方法，確定了特異性，與傳統(tǒng)ELD50測定方法進行了敏感性和相關性比較，間接免疫熒光方法定值lgTCID50結果為5.59±0.14，傳統(tǒng)雞胚半數(shù)致死量方法定值的lgELD50結果為4.19±0.15，可見間接免疫熒光方法具有更高的敏感性。兩種方法的相關性系數(shù)r為0.83944，表明間接免疫熒光TCID50方法與傳統(tǒng)ELD50方法測定疫苗病毒含量值具有高度的相關性。而且，該方法避免使用雞胚，降低了檢驗成本，縮短了檢驗周期。本研究為該疫苗的檢驗提供了一個新途徑。陶素華［6］等報道不同毒株的雞傳染性法氏囊病毒可適應于Vero細胞，今后可增加相關研究將該方法推廣到其他雞傳染性法氏囊病毒疫苗的病毒含量測定。

［1］鄭建浩.淺談雞傳染性法氏囊病的診斷與防治［J］.畜禽業(yè).2008(4):82-83.

［2］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二○一○年版［S］.

［3］于維軍.國外傳染性法氏囊病病毒學及免疫學的研究進展［J］.中國畜禽傳染病.1990，54(5):55-58.

［4］中國醫(yī)學科學院流行病防治研究所.常見病病毒實驗技術［M］.北京:科學出版社，1978:55.

［5］楊金秀.統(tǒng)計學原理［M］.長沙:中南大學出版社，2007:263.

［6］陶素華，韋 莉，孫延濤，等.雞傳染性法氏囊病病毒適應于Vero細胞的初步研究［J］.中國獸醫(yī)雜志，1995，21(12):3-5.