乳酸乳球菌Lactococcuslactis1.2472 usp45基因的克隆與原核表達(dá)

葉 飛，李 昌，任大勇，，秦艷青，朱 翯，杜壽文，金寧一

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長春 130122；3.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院，吉林 九站 132101）

近年來，微生態(tài)制劑應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖受到廣泛關(guān)注。它能有效提高畜禽對病原菌的抵抗能力，改善畜禽健康狀況。乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）作為重要的益生菌在微生態(tài)制劑的開發(fā)中具有良好前景。

乳酸菌是一類能夠利用糖類代謝產(chǎn)生50%以上乳酸的細(xì)菌，主要分布于消化道和泌尿生殖道等部位，占消化道有益菌總量的50%以上[1-2]。研究表明，乳酸菌能夠恢復(fù)或增強(qiáng)腸道穩(wěn)態(tài)，抑制病原菌侵染，促進(jìn)消化吸收，增強(qiáng)宿主免疫功能[3-4]；近年來人們發(fā)現(xiàn)其與黏膜免疫系統(tǒng)相互作用，具備黏膜疫苗載體的潛能[5]。

乳酸菌胞外分泌蛋白，對于乳酸菌環(huán)境適應(yīng)、細(xì)胞壁新陳代謝、通信以及定植宿主黏膜部位等方面具有重要作用[6-7]。對其的研究，能夠揭示乳酸菌如何適應(yīng)黏膜局部環(huán)境，發(fā)揮益生功能改善宿主的微生態(tài)平衡。usp 45蛋白是本課題組從乳酸乳球菌Lactococcus lactis 1.2472培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)的一種大量且穩(wěn)定表達(dá)的胞外分泌蛋白。大量的組成型表達(dá)揭示其對于乳酸菌的環(huán)境適應(yīng)及益生功能具有重要作用。本試驗(yàn)從乳酸乳球菌Lactococcus lactis 1.2472基因組中克隆獲得usp45基因，并進(jìn)行原核表達(dá)與純化，為進(jìn)一步研究該蛋白的功能奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而為相關(guān)微生態(tài)制劑和黏膜免疫調(diào)節(jié)制劑的開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 乳酸乳球菌Lactococcus lactis 1.2472、表達(dá)載體，pET-28a本室保存；克隆載體pMD18-T simple Vector、Ex-Taq酶、dNTP MIX、限制性內(nèi)切酶BamH I、EcoR I，購自TaKaRa（大連）公司；E.coli DH 5α、E.coli BL21（DE3），購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、小鼠Anti-His Antibody，購自TIANGEN生物公司；質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒，購自AxyGen（杭州）公司；Biospin凝膠回收試劑盒，購自BioFlux公司；Ni-NTA親和層析柱，購自QIAGEN公司；堿磷酶標(biāo)記馬抗小鼠IgG，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；IPTG/BCIP/NBT，購自Promega公司。

1.2 usp45基因的擴(kuò)增 由usp 45基因（登錄號：M 60178.1）兩側(cè)特異性序列設(shè)計(jì)引物。序列為：FP：5′-ggggATCCATGAAAAAAAAGATTATCTCAGCTA（引入BamH I酶切位點(diǎn)）；RP：5′-gggAATTCCTA gtgatgatgatgatgatg-3′GTTTGGCATCAAGAAAG（引 入EcoR I酶切位點(diǎn)和His-tag標(biāo)簽序列）。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

以乳酸乳球菌Lactococcus lactis 1.2472基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增usp 45基因。反應(yīng)條件：94℃，5 min；94℃變性30 S，58℃退火45 S，72℃延伸2 min，38個(gè)循環(huán)；72℃，10 min?；厥諗U(kuò)增片段，連入克隆載體pMD18-T simple，獲得pT-usp 45質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入E.coli DH 5α。BamH I/EcoR I雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，并送上海英濰捷基公司測序鑒定。

1.3 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 pT-usp 45質(zhì)粒與表達(dá)載體pET-28a經(jīng)BamH I/EcoR I雙酶切，回收片段，T4連接酶16℃連接6 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH 5α。經(jīng)BamH I/EcoR I酶切鑒定，獲表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-usp 45。

1.4 usp45的誘導(dǎo)表達(dá) 將pET-28a-usp 45轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3），于LB（Kan+），37 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。取50 μL菌液于5 mL LB（Kan+），220 r/min（37 ℃）振蕩培養(yǎng)2～3 h，至OD600值為0.6，加入IPTG至終濃度1.0 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)5 h。

1.5 usp 45表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的菌液經(jīng)12 000 r/min離心3 min，收集上清與沉淀制備蛋白樣品。上清液：取1 mL冰浴，加入0.34 g（NH4）SO4，4℃靜置過夜后，12 000 r/min（4℃）離心25 min，收集沉淀，100 μL細(xì)菌裂解液懸起，即得“上清液蛋白樣品”。菌體沉淀：100 μL細(xì)菌裂解液懸起菌體沉淀，超聲波破碎（工作/間歇各15 s，25個(gè)循環(huán)），12 000 r/min離心10 min后，分別收集上清與沉淀，即得“破碎后上清蛋白樣品”與“破碎后沉淀蛋白樣品”。

上述蛋白樣品，“pET-28a”為空白對照，“pET-28a-usp45未誘導(dǎo)”為陰性對照，10%SDS-PAGE分析。

1.6 usp 45表達(dá)產(chǎn)物的Western blot分析 pET-28a為陰性對照，“破碎后沉淀蛋白樣品”（見1.5），經(jīng)SDS-PAGE電泳，用半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)15 v，31 min轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。5%脫脂乳4℃封閉過夜，一抗（抗His小鼠IgG單抗）室溫孵育2 h，二抗（堿磷酶標(biāo)記馬抗小鼠IgG）室溫孵育1.5 h，BCIP/NBT顯色，觀察結(jié)果。

1.7 usp 45表達(dá)產(chǎn)物的層析純化 制備“破碎后沉淀蛋白”（見1.5），利用usp 45蛋白尾部添加的His-tag標(biāo)簽，由“Ni-NTA親和層析柱”按照操作說明，純化usp 45蛋白，并用SDS-PAGE鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 usp45基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果 從乳酸乳球菌Lactococcus lactis 1.2472基因組，PCR擴(kuò)增獲得usp 45基因，片段長1 371 bp（見圖1）。

2.2 克隆質(zhì)粒pT-usp 45雙酶切鑒定與測序鑒定構(gòu)建的克隆質(zhì)粒pT-usp 45，經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切可見1 371 bp的目的基因片段和2 671 bp的載體片段，與預(yù)期結(jié)果一致（見圖2）。測序結(jié)果顯示，pT-usp 45質(zhì)粒中連接入usp 45基因。克隆質(zhì)粒pT-usp 45構(gòu)建成功。

2.3 表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-uusp 45的構(gòu)建與鑒定BamH I和EcoR I酶切pT-usp 45質(zhì)粒，獲得usp 45基因片段，連入表達(dá)載體pET-28a，獲得表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-usp 45。BamH I和EcoR I雙酶切可見1 371bp的目的基因片段和5 363 bp的載體片段，與預(yù)期結(jié)果一致（見圖3）。表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-usp 45構(gòu)建成功。

2.4 usp 45表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析 pET-28a-usp 45轉(zhuǎn)化的E.coli BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5 h。超聲波破碎處理，獲得“上清液蛋白樣品”、“破碎后上清蛋白樣品”、“破碎后沉淀蛋白樣品”，用10%SDS-PAGE電泳分析（見圖4）。在“破碎后沉淀蛋白樣品”（泳道7）中有約50 kDa蛋白質(zhì)分子的大量特異性誘導(dǎo)表達(dá)。表明目的蛋白表達(dá)成功。

2.5 usp 45表達(dá)產(chǎn)物的Western blot分析 “破碎后沉淀蛋白樣品”進(jìn)行Western blot分析；pET-28a空質(zhì)粒為陰性對照（見圖5）。結(jié)果顯示，重組菌誘導(dǎo)表達(dá)usp 45蛋白，usp 45基因原核表達(dá)成功。

2.6 usp 45表達(dá)產(chǎn)物的層析純化 “破碎后沉淀蛋白樣品”，用Ni-NTA親和層析純化，產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析（見圖6）。結(jié)果顯示，純化獲得約50 kDa蛋白質(zhì)，即為usp 45蛋白。

3 討論

乳酸菌在動(dòng)物黏膜部位發(fā)揮益生功能，涉及菌體之間、菌體與其他微生物之間、菌體與宿主黏膜部位細(xì)胞之間的相互作用。乳酸菌胞外分泌蛋白在此發(fā)揮影響作用。對于乳酸菌胞外分泌蛋白的研究，能夠更好理解乳酸菌在腸道內(nèi)定植的規(guī)律；了解其與腸道其他菌群相互作用關(guān)系；了解其與宿主胃腸道黏膜細(xì)胞相互作用關(guān)系[7-9]。

本實(shí)驗(yàn)室從乳酸乳球菌Lactococcus lactis 1.2472培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)一種較大量組成型表達(dá)的胞外分泌蛋白。經(jīng)質(zhì)譜鑒定與Blast同源分析表明，其即為usp 45蛋白（結(jié)果未發(fā)表）。穩(wěn)定的高表達(dá)預(yù)示其對于乳酸菌的基本生理功能以及乳酸菌與環(huán)境、宿主的相互作用具有潛在的重要功能。本試驗(yàn)從乳酸乳球菌Lactococcus lactis 1.2472基因組中擴(kuò)增獲得usp 45基因，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-usp45，成功進(jìn)行了原核表達(dá)及純化，為進(jìn)一步研究usp45蛋白在乳酸菌發(fā)揮益生功能中的作用奠定了良好基礎(chǔ)。

[1]Vaughan E E，de Vries M C，Zoetendal E G，et al.The intestinal LABs[J].Antonie Van Leeuwenhoek，2002，82（14）:341-352.

[2]Klaenhammer T R，Altermann E，Pfeiler E，et al.Functional genomics of probiotic Lactobacilli[J].J Clin Gastroenterol，2008，42（2）:160-162.

[3]Banjoko I O，Adeyanju M M，Ademuyiwa O，et al.Hypolipidemic effects of lactic acid bacteria fermented cereal in rats[J].Lipids Health Dis，2012，11：170.

[4]Berlec A，Ravnikar M，Strukelj B.Lactic acid bacteria as oral delivery systems for biomolecules[J].Pharmazie，2012，67（11）:891-898.

[5]Chatel J M，Langella P，Adel-Patient K，et al.Induction of mucosal immune response after intranasal or oral inoculation of mice with Lactococcus lactis producing bovine beta-lactoglobulin[J].Clinical and diagnostic laboratory immunology，2001，8（3）:545-551.

[6]Van Baarlen P，Troost F J，van Hemert S，et al.Differential NF-kappaB pathways induction by Lactobacillus plantarum in the duodenum of healthy humans correlating with immune tolerance[J].Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（7）：2371-2376.

[7]Raimann E，Schmid B，Stephan R，et al.The alternative sigma factor sigma of L.onocytogenes promotes growth under diverse environmental stresses[J].Foodborne Pathog Dis，2009，6（5）:583-591.

[8]Zhou M，Boekhorst J，F(xiàn)rancke C，et al.Locate P:genome-scale subcellular-location predictor for bacterial proteins[J].BMC Bioinformatics，2008，9：173.

[9]Martien van Asseldonk，Ger Rutten,Marco Oteman，et al.Cloning of usp45，a gene encoding a secreted protein from Lactococcus lactis subsp.Lactis MG1363[J].Gene，1990，95（1）:155-160.